鸡γ干扰素基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素cDNA基因序列设计一对引物,以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素基因,把它与融合表达载体pET32a相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与原核表达

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过一对自行设计的引物,从经ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的RNA中扩增出一特异性基因片段,其大小约为500 bp.该片段经酶切和测序鉴定为鸡IFN-γ基因.将其插入原核表达载体pGEX-4T-1, 并导入大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导培养,获得分子量约为43 000的蛋白带,表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到表达.     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组茵。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100％。鸡γ-干扰素蛋白合有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25％。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

为了研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）基因的功能并进一步探究其在控制家禽传染病方面的应用，根据GenBank已发表的ChIFN-γ cDNA基因序列自行设计引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激培养鸡脾淋巴细胞中提取的总RNA中扩增得到ChIFN-γ，然后连接到pMD18-T载体上并转化到Top10感受态细胞中，获得阳性重组质粒并进行正确性序列测序．核甘酸序列结果表明，试验得到了长为513bp的ChIFN-γ基因，与原鸡（Gullus）IFN-γ的同源性可高达100％，其含有1个495bp的开放性阅读框架，编码164个氨基酸，推测其成熟蛋白的相对分子质量约为18000．     

鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。     

鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

广西三黄鸡γ-干扰素基因真核表达载体的构建及表达

设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1 CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1 CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

在人类文明发展中,人与自然的关系经历了人类对自然的顺从、依附到人类对自然的主宰。工业文明时期,人与自然的关系是对立的,人类把自然看成是掠夺的对象,致使生态危机日益严重。生态文明蕴含着人与自然和谐统一的关系。它承认自然具有内在价值,它以生态科技作为物质基础,实行生态化的生产方式和消费方式。     

猪γ干扰素基因的克隆表达及其抗原性的初步研究

为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,克隆并表达了猪IFN-γ基因。首先应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,分别将其定向插入原核表达载体pGEX-4T-1和pET-32 a中,经测序表明与已报道的核苷酸序列同源性为100%。接着将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ分别转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白均以不溶性的包涵体形式存在,分子量分别为43.0和35.0 ku,与理论推算值相符。为研究IFN-γ在表达中结构的变化,采用上述2种融合蛋白分别作为免疫抗原和检测抗原。结果用GST-poIFN-γ免疫小鼠所诱导的抗体可与poIFN-γ产生特异性结合,表明不同原核质粒表达的猪IFN-γ仍保持其特有的结构。     

油菜偏嗜性ChIFN-γ基因合成及原核表达

依据鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的氨基酸序列,采用油菜偏嗜性的密码子,人工合成ChIFN-γ,构建原核表达载体pET32a-ChIFN-γ,并转化到E. coli BL21中.1 mmol·L-1 IPTG 37℃诱导表达12h ChIFN-γ表达量达到菌体总蛋白的37%.SDS-PAGE电泳检测表明,ChIFN-γ重组蛋白分子量约为33kDa.研究为下一步制备ChIFN-γ抗体进行真核表达研究奠定了基础.     

萧山鸡γ-干扰素(IFN-γ)成熟蛋白基因的克隆、原核表达及真核表达载体的构建

以有丝分裂原ConA诱导鸡脾脏淋巴细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术获得了萧山鸡γ-干扰素成熟蛋白基因495 bp的序列,GenBank登录号为DQ470471。序列分析表明,与已经发表的鸡γ-干扰素成熟蛋白基因序列的核苷酸同源性为95%-99.9%。将该cDNA序列构建得到鸡γ-干扰素的原核表达载体pET30a-ChIFN-γ,成功在大肠杆菌中表达了分子量20.88 kD的目的蛋白,与预期分子量一致;并构建得到了鸡γ-干扰素的pCI真核表达载体（pCI-ChIFN-γ）。     

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素IS(ChlL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18.将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌B121(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18).SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18.Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应.融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性.     

鸡α-干扰素成熟肽的原核表达及其多价血清的制备

以PCR方法从活化的鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素的成熟肽基因序列,构建原核表达质粒pET32a-α和pGEX6p-α;SDS-PAGE及Western blotting法检测两载体特异性表达成熟肽;将纯化的pET32a-α诱导表达产物免疫小鼠,收获小鼠血清并以pGEX6p-α诱导表达产物检测其中特异性抗体滴度。结果表明:扩增的鸡α-干扰素成熟肽基因成功表达,原核表达产物免疫小鼠可产生特异性抗体,抗体效价为1∶12 000。其结果为制备安全、高效的重组干扰素奠定了基础,为定量检测机体内产生的α干扰素进而了解机体免疫状态提供较为可靠的技术手段。     

重组γ干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达

重组质粒pCG25(IFN-γ)转化大肠杆菌DH5 α,接种LB培养基,在32℃培养,42℃诱导后经SDS-PAGE凝胶电泳分析,γ-干扰素基因在大肠杆菌细胞中表达的蛋白质为18 Kd,诱导6 h达到最高峰,表达活性为1.2×108IU/L菌液,对酸(pH2)和热(60℃)不稳定.     

牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。