中华卵索线虫β-actin基因的克隆与分析

利用RACE技术克隆中华卵索线虫Ovomermis sinensisβ-actin基因,RT-PCR方法检测该基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达情况。结果首次获得了中华卵索线虫β-actin基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1636bp,其中ORF长1131bp,编码376个氨基酸;5′UTR长137bp;3′UTR长367bp。由该cDNA推导的蛋白质序列与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、人类等物种的β-actin蛋白序列相似性均在95%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。β-actin基因在不同发育时期的线虫中持续恒量表达。由此推断中华卵索线虫β-actin基因具有高度保守性,可以作为生物物种进化的分子标志,且能较好反映物种间的系统发生关系,是量化实验的理想内标参照。     

小菜蛾GluCl受体α亚基cDNA基因克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术对小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]4龄幼虫谷氨酸门控的氯离子通道(GluCl)受体cDNA全长进行了克隆和序列分析。通过设计简并性上、下游引物扩增出小菜蛾GluCl受体α亚基基因192bp的cDNA片段,根据得到的片段序列设计3′和5′特异性引物采用RACE技术进行3′和5′末端的克隆,获得了小菜蛾GluCl受体的cDNA的完整序列,GenBank登录号为GQ221939。该基因全长2144bp,其开放阅读框(ORF)1344bp,编码447个氨基酸。相似性分析表明:它与果蝇和赤拟谷盗的相似性均为73%,与埃及伊蚊的相似性为75%,与东亚飞蝗的相似性为79%;氨基酸分析后显示它具有GluClα亚基的典型特征,表明克隆的cDNA序列是小菜蛾GluClα亚基基因的序列。     

赤拟谷盗β1-微管蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

本研究利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术对赤拟谷盗Tribolium casta-neum体内β1-微管蛋白(β1-tubulin)基因进行了克隆,获得的基因(EU555191)全长为1573bp,包含1344bp的完整开放阅读框(ORF)。根据该基因推导出447个氨基酸序列,理论分子量约为50KD,等电点为4.68,该序列含有2个氨基酸保守区:NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE,并且在该基因的5’端启动子调控区发现TATA-box保守基因序列。系统发育关系研究表明:本研究扩增出的基因与其它昆虫β-tubulin基因序列有较高的同源性,达90%左右。     

华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠羧酸酯酶基因 HoCL1的克隆与序列分析

利用粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)围食膜蛋白多克隆抗体,从已构建的华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita 中肠cDNA表达文库中筛选得到1个编码羧酸酯酶的cDNA克隆 HoCL1 ,其开放阅读框(ORF)长1 599 bp,编码532个氨基酸,推导的蛋白质分子质量为59.5 kDa,等电点(p I)为4.5。 HoCL1蛋白具有羧酸酯酶的保守结构域:1个二硫键形成的位点和1个丝氨酸活性中心,三联体催化活性中心位于Ser207、Asp333和His422上,不含有氮联糖基化位点和氧联糖基化位点,只含有3 个半胱氨酸残基。依据氨基酸序列同源性分析和保守结构域分析,HoCL1属于B类酯酶,与赤拟谷盗 Tribolium castaneum 羧酸酯酶相似性最高,为35.2%。通过与其他昆虫羧酸酯酶序列比对及构建系统发育树,发现HoCL1羧基端的氨基酸序列保守性低,但靠近N端的活性中心处的氨基酸序列则高度保守,可与赤拟谷盗、异色瓢虫 Harmonia axyridis 羧酸酯酶聚类在一起。羧酸酯酶 HoCL1 基因的克隆鉴定为进一步研究该基因在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能奠定了基础。     

黏虫体内两种微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

以黏虫4龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到该虫的α和β微管蛋白基因的cDNA序列各1条。其中α微管蛋白基因的cDNA序列1 443个碱基,包括一个1 353个碱基的开放阅读框,编码一个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50.0ku。氨基酸的142~148位存在一个微管蛋白标志信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端有一个酪氨酸残基,N-端存在一个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α微管蛋白氨基酸序列相同。黏虫β微管蛋白基因cDNA序列含1 906个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2ku,等电点4.75。1~4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140~146GGGTGSG位同样存在一个微管蛋白标志信号片段。序列比对表明,克隆的α和β微管蛋白基因与其他昆虫的α和β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,黏虫与家蚕(Bombyx mori)α微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.3%,与其他3种夜蛾科昆虫α微管蛋白的氨基酸序列同源性更是达到100%。黏虫与家蚕β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与烟草天蛾β微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.6%。两个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号分别为EU100016和EU234504。     

大草蛉雄虫卵黄原蛋白基因的鉴定和表达特征

为探索卵黄原蛋白基因对大草蛉雄虫生殖生理等活动的调节作用,利用PCR技术克隆了大草蛉卵黄原蛋白基因部分cDNA序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,通过实时荧光定量PCR技术检测了该基因在不同发育阶段和不同组织的表达特征.结果表明,克隆到的卵黄原蛋白基因的cDNA长度为1501 bp,编码501个氨基酸,其预测的蛋白...     

韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响

为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%～43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0～10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0～40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤...     

一株茶树内生淡紫拟青霉的鉴定及抗真菌活性研究

采用形态学观察及ITS序列分析对1株分离自健康茶树叶片的内生真菌进行鉴定,初步确定该菌株为淡紫拟青霉;并通过对峙培养和发酵液的抑菌试验研究其对真菌的抗生作用.结果表明,淡紫拟青霉FHM-1对7种茶树内生真菌和10种植物病原菌均有较强的抑菌作用;其发酵液对供试的16种真菌具有不同程度的抑制作用,而对拟盘多毛孢的生长有较强的促进作用.     

淡紫拟青霉M-1固体发酵工艺优化及基于自动化种曲机的中试生产

淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus在线虫生物防治上表现出巨大的潜力,但大规模生产技术的不成熟以及产品货架期短限制其工业化生产。为获得淡紫拟青霉M-1固体发酵的最佳条件,并建立其规模化生产工艺,本研究采用单因素和正交试验对淡紫拟青霉M-1固体发酵培养的组成、发酵条件以及烘干条件进行了优化,结果表明淡紫拟青霉M-1固体发酵最佳的培养基组成为麸皮：玉米粉为1：1、蔗糖添加量5%、尿素添加量0.1%、硫酸铵添加量0.1%、料水比1：0.67,固体发酵最佳的培养条件为培养温度28℃、培养时间为7 d、液体接种量为5%、固体接种量为0.5%,固体菌剂最适烘干条件为在35℃烘干24 h,在此条件下淡紫拟青霉M-1固体菌剂的有效活菌数为9.47×10⁹ CFU/g。在此基础上,基于自动化种曲机,建立淡紫拟青霉M-1规模化固体发酵工艺,并通过3个批次规模化生产进行验证,获得将近2 t淡紫拟青霉M-1固体菌剂产品,菌剂有效活菌数能达到15.6×10⁹ CFU/g,杂菌率极低（<0.01%）,水分含量为9.68%。由此说明,该工艺可用于淡紫拟青霉M-1工业化生产,且产品质量优异。     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

玉米衰老相关蛋白基因ZmSAP的克隆与表达分析

利用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导胁迫下玉米高耐纹枯病自交系幼苗叶片所构建的cDNA文库中获得的EST序列,通过电子克隆和RT-PCR方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从玉米叶片中分离克隆到衰老相关蛋白基因的全长cDNA序列,命名为ZmSAP(GenBank登录号:GU253311)。序列分析表明,ZmSAP全长1156bp,包含一个完整的603bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码200个氨基酸,相对分子量为21.92kD,等电点为10.38。该氨基酸序列与豌豆、挪威云杉、寄生藻等有不同程度的同源性且在不同物种间具有一个保守结构域,染色体定位发现该基因位于玉米第1条染色体上。荧光定量PCR分析表明,在高耐纹枯病自交系R15和高感纹枯病材料478中ZmSAP基因在病菌胁迫初期呈诱导表达,可能参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程,说明该基因与纹枯病菌胁迫响应机制密切相关。     

麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列,明确其典型特征,为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列,利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584）,SaNa_v1序列长3423 bp,共编码1141个氨基酸;SaNa_v2序列长2874 bp,共编码958个氨基酸。同源比对发现,SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%;SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域,每个结构域6个跨膜片段（S1～S6）,存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因,为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。     

西花蓟马FoccOBP3的分子克隆、序列分析及表达特征

鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据.本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3(GenBank登录号:MT682352),cDNA序列全长1226bp,读码框全长432bp,编码143个氨基酸残基.氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为...     

耐草甘膦菜豆耐性分子学机理研究

用耐性菜豆根尖为材料，以λgt10为载体获得了4.8×105个重组噬菌体的cDNA文库。以植物EPSP合成酶基因保守序列合成二段探针，经噬菌体原位杂交筛选出了阳性克隆，并进行了酶切鉴定。测定 cDNA 序列长度为2024个核苷酸，其中编码长1569个核苷酸，共编码523个氨基酸和一个终止密码子，与已发表的其它植物成熟EPSP合成酶氨基酸序列相比具有很高的同源性（≥84.8%），但进入叶绿体运输肽的氨基酸同源性低。以耐性菜豆EPSP合成酶的cDNA序列为模板，用RT-PCR方法扩增感性菜豆EPSP合成酶cDNA片段，并克隆于pUC18质粒上，经测定序列并比较发现:感性菜豆EPSP合成酶cDNA核苷酸序列1737位碱基为G，而耐性的为C，从而表达出的513位氨基酸残基感性的为E，耐性的为Q，表明两种菜豆EPSP合成酶cDNA核苷酸序列一位点的差异是它们对草甘膦耐性不同的原因。     

桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

华北大黑鳃金龟气味受体OrCo基因的克隆及序列分析

嗅觉受体OrCo(olfactory receptor coreceptor)在不同昆虫体内高度保守,克隆华北大黑鳃金龟[Holotrichiaoblita(Falderman)]OrCo基因可以为进一步探索受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法,克隆获得华北大黑鳃金龟OrCo受体基因cDNA全长序列。将该基因命名为Hobl/Or-Co。序列分析结果显示,Hobl/OrCo全长共1 598bp,开放阅读框全长1 434bp,编码477个氨基酸,序列中有7个跨膜区和高度保守的C端区域。Hobl/OrCo基因的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟嗅觉受体的同源性高达95.39%,与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性在76%以上,特别是在C端几乎完全一致。     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

小地老虎2种不同类型肌动蛋白基因的克隆与序列分析

本研究以鳞翅目夜蛾科昆虫小地老虎［Agrotis ipsilon（Hüfnagel）］3龄幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术（RACE）,分别扩增得到2条肌动蛋白的cDNA序列Aiactin1和Aiactin2。GenBank数据库搜索及序列比对结果表明,克隆的2条肌动蛋白基因应属于2种不同类型的肌动蛋白,Aiactin1为肌肉特异型肌动蛋白,Aiactin2为细胞质特异型肌动蛋白。Aiactin1的cDNA序列含有1 469个碱基,Aiactin2的cDNA序列含有1 408个碱基。2条基因的cDNA序列均包括一个1 131个碱基的开放阅读框,编码一个含376个氨基酸的蛋白。Aiactin1肌动蛋白分子量约为41.77 ku,等电点5.22;Aiactin2肌动蛋白分子量约为41.83 ku,等电点5.47。Prosite软件分析结果表明,Aiactin1和Aiactin2肌动蛋白氨基酸序列中都存在3个肌动蛋白特征片段。2个基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号。     

番茄斑萎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与分析

从云南表现褪绿黄化症状的番茄上分离到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)YN-1株系,利用RT-PCR方法克隆了该株系的核衣壳蛋白基因,并测定了该基因的序列,全长为777 bp,编码258个氨基酸。对该基因的氨基酸序列分析结果表明,YN-1 N基因与韩国3个株系的氨基酸序列相似性均高达97%。