siRNA沉默NCOA2基因对猪肌内前体脂肪细胞分化的影响

[目的]本文旨在研究核受体共激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。[方法]用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测NCOA2在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化;通过NCOA2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制内源NCOA2的表达,并用油红O染色检测沉默NCOA2对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响,通过qRT-PCR检测沉默NCOA2对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和脂联素(adiponectin,ADIPOQ)表达的影响。[结果]NCOA2在肌内前体脂肪细胞分化第4天表达量显著升高(P0.05);降低NCOA2表达可显著抑制肌内前体脂肪细胞分化(P0.05),且PPARγ、FABP4、LPL和ADIPOQ基因的表达也受到显著抑制(P0.05)。[结论]体外siRNA沉默NCOA2基因可抑制猪肌内前体脂肪的分化,这可能与PPARγ、FABP4、LPL、ADIPOQ等基因的低表达有关。     

慢病毒介导shRNA抑制Sirt1基因表达对猪前体脂肪细胞凋亡的影响

【目的】探讨慢病毒介导的shRNA干扰系统抑制脱乙酰基酶1(Sirtuin type 1,Sirt1)表达对猪前体脂肪细胞凋亡的影响。【方法】构建pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体,将其感染猪前体脂肪细胞,运用Hoechst33258染色,于荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western印迹检测细胞凋亡标志物Cleaved caspase-3的表达情况。【结果】pLentiH1-Sirt1shRNA慢病毒载体可抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显微镜下可见细胞体积缩小、染色质凝集、核固缩等典型的凋亡特征;流式细胞术显示细胞凋亡率较空载体对照组明显增加,早期和晚期凋亡细胞百分率分别从4%和9%(P0.05)上升至30%和32%(P0.05);Western印迹检测显示Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调。【结论】慢病毒介导的shRNA可有效地抑制猪前体脂肪细胞中Sirt1的表达,显著促进细胞凋亡,提示Sirt1可能在前体脂肪细胞凋亡中发挥着重要作用。     

猪前体脂肪细胞的培养方法及生物学特征研究

[目的]研究大白猪前体脂肪细胞培养方法[方法]选用出生3d的仔猪脂肪组织,采用原代消化细胞法进行分离,培养后,研究猪脂肪组织增生的生物学特征[结果]结果表明,培养的原代细胞经传代后成分均一、生长旺盛充脂率高,培养细胞含有可被油红O染色的脂滴,具有前脂肪细胞的典型特征。[结论]试验建立的培养方法适用于脂肪细胞的培养和纯化,脂肪细胞特征典型。     

猪OLR1基因对肌内前脂肪细胞分化的影响

研究氧化型低密度脂蛋白受体1(oxidized low-density lipoprotein receptor1,OLR1)基因在猪前脂肪细胞分化过程中的作用,为深入研究OLR1基因在脂肪沉积中的功能奠定基础。根据GenBank中猪OLR1基因序列(登录号:NM₂13805),构建OLR1基因过表达载体OLR1-pcDNA3.1,同时合成干扰OLR1表达的siRNA。从恩施黑猪背最长肌中分离前脂肪细胞,分别将OLR1-pcDNA3.1和OLR1-siRNA转染前脂肪细胞,并对细胞进行诱导分化,至第6天,通过油红O染色、甘油三酯含量测定和荧光定量PCR检测OLR1基因对前脂肪细胞分化的影响。结果显示,OLR1过表达组脂滴明显多于对照组,甘油三酯含量显著(P<0.05)增加,成脂分化标志基因PPARγ的表达量极显著(P<0.01)升高、C/EBPα和FAS的表达量显著(P<0.05)升高;干扰OLR1后,细胞内脂滴减少,甘油三酯含量显著(P<0.05)下降,成脂分化标志基因PPARγ的表达量极显著(P<0.01)下降,C/EBPα和FA...     

松辽黑猪前体脂肪细胞分离及诱导分化

为建立松辽黑猪前体脂肪细胞分化体系,了解其增殖规律及相关的脂肪标志基因在细胞分化过程中的相对表达。选用7日龄松辽黑猪,用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织得到前体脂肪细胞,传代后进行形态学观察并绘制生长曲线,利用传统"鸡尾酒"法进行诱导分化,油红O对分化后的细胞进行染色,判断分化效果,提取总RNA,对成脂标志基因进行相对表达量分析。结果表明:分离获得的松辽黑猪原代前体脂肪细胞可贴壁生长,形似成纤维细胞,细胞生长曲线符合细胞生长规律,近似"S"形;诱导分化后的细胞具有成熟脂肪细胞的典型特征,细胞内聚集大量脂滴;诱导后第10天,细胞内甘油三酯含量极显著提高;成脂标志基因PPARγ、C/EBPα在分化后的细胞中相对表达量极显著升高(P<0.01),而FoxO1在分化前相对表达量最高,第5天表达量与第0天相比极显著下降(P<0.01),但第10天的表达量极显著高于第5天(P<0.01),且第10天表达量与第0天无显著差异(P>0.05)。试验建立了松辽黑猪前体脂肪细胞的分离体系,为进一步研究松辽黑猪脂肪沉积与代谢机制以及改善肉质提供了依据。     

FSTL1基因促进猪前体脂肪细胞分化成脂的机制

【目的】构建猪FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,探究FSTL1基因对猪前体脂肪细胞分化成脂的作用及机制。【方法】通过构建FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,在猪前体脂肪细胞中过表达、干扰FSTL1基因并诱导其分化,测定细胞中甘油三酯含量以及脂肪细胞分化相关调节基因的m RNA表达量。【结果】成功克隆得到猪FSTL1基因c DNA序列,其开放阅读框全长924 bp,并将序列提交到GenBank,登录号为KF021281。成功构建猪FSTL1基因的过表达载体pcDNA3.1-FSTL1和RNAi载体pSilencer4.1-491以及pSilencer4.1-530。过表达FSTL1基因促进了猪前体脂肪细胞中甘油三酯生成,干扰FSTL1基因抑制了猪前体脂肪细胞中甘油三酯的生成。FSTL1在猪前体脂肪细胞中使PPARγ2和AP2基因表达分别上调了73%和113%,使LPL、 Adiponectin和FASN等基因表达分别下调了44%、79%和16%。【结论】FSTL1基因通过上调PPARγ2和AP2基因,下调LPL、Adiponectin及FASN基因的表达,促进猪前体脂肪细胞的分化,提高猪前体脂肪细胞中甘油三酯的含量。     

烟酰胺削弱罗格列酮诱导猪前体脂肪细胞凋亡的作用与分子机制

【目的】探讨烟酰胺（nicotinamide, NIC）和罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制,寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol•L-1 RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞,在处理后的48 h,对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白,用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平;基于RSG促凋亡的浓度梯度结果,选用1.0 mmol•L-1 RSG分别与含0、0.1、0.2和0.3 mmol•L-1 NIC的培养基共处理细胞,在处理后的48 h,染色并观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,检测细胞凋亡关键基因的蛋白水平。【结果】 RSG以浓度依赖方式诱导猪前体脂肪细胞凋亡,减少了细胞数目;Bcl-2和cleaved Caspase-3凋亡关键蛋白水平随RSG浓度增加而上升,Bax则下降;0.1（P＜0.05）、0.2（P＜0.01）和0.3 mmol•L-1 （P＜0.01）NIC显著削弱1 mmol•L-1 RSG诱导猪前体脂肪细胞凋亡,Bcl-2和cleaved Caspase-3水平显著被下调（P＜0.05）,Bax则被上调（P＜0.05）;0.3 mmol•L-1 NIC明显有助于1 mmol•L-1 RSG处理的猪前体脂肪细胞中的Sirt1由细胞质向核转移,且抑制核中cleaved Caspase-3水平。【结论】NIC通过促进Sirt1由细胞质到核的转位以及下调核中cleaved Caspase-3水平削弱RSG诱导的猪前体脂肪细胞凋亡。     

八眉猪肌内前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

以域型胶原酶消化5日龄八眉猪仔猪背最长肌组织,分离肌内前体脂肪细胞,经差速贴壁法纯化后接种培养,以RT-PCR 和油红O 染色法对分化前后的细胞进行鉴定,通过观察细胞形态变化,细胞贴壁率测定,及用MTT法检测增殖活性,油红O染色提取法检测成脂诱导分化过程中细胞脂肪含量的变化,分析前体脂肪细胞生长特性和分化能力。结果表明,分离的八眉猪肌内前体脂肪细胞呈梭状、形似成纤维细胞,贴壁性能好,贴壁率最高可达90%;细胞生长良好增殖曲线呈“S”型,符合正常的细胞生长规律;肌内前体脂肪细胞体外自发分化能力弱,但经成脂诱导,可以分化为具有脂肪细胞典型特征的成熟脂肪细胞,分化水平以时间依赖方式显著提高。     

葡萄糖浓度对实验小型猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响

为了探索不同浓度葡萄糖对实验用小型猪前体脂肪细胞增殖和分化的影响,本文采用胶原酶消化法分离皮下前体脂肪细胞,采用高浓度葡萄糖(4500mg/L)和低浓度葡萄糖(1000mg/L)DMEM培养基对细胞进行培养和体外诱导成脂分化,结果表明,与低浓度组相比,高浓度葡萄糖可显著促进实验用小型猪前体脂肪细胞的增殖,体外诱导分化后...     

L-Gln对大鼠前体脂肪细胞的影响

设置养分贮存损失状态不同的4类培养液,分别添加一定浓度梯度的L-谷氨酰胺(L-G lu tam ine,L-G ln)培养大鼠前体脂肪细胞。通过形态学观察、M TT比色、油红O染色提取法,比较各组细胞形态及增殖与分化的效果。结果表明,添加0 mm o l/L L-G ln的新鲜培养液和配制后4℃冷藏20 d,再添加0.685 mm o l/L L-G ln的培养液,均较利于前体脂肪细胞的增殖与分化;配制后4℃冷藏90 d的培养液,对前体脂肪细胞培养效果较差,添加L-G ln也不能使培养效果得到改善。另外,启封后的M 199和胎牛血清(F eta l C a lf Serum,FCS)分别冷藏不宜超过90 d。说明及时满足培养液中L-G ln的需求量,可使前体脂肪细胞达到较好的增殖与分化状态。     

共轭亚油酸对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响

共轭亚油酸（CLA）是一类具有多种生物学功能的同分异构体的总称。采用细胞计数、油红O染色提取法确定CLA对大鼠前体脂肪细胞增殖与分化的影响。结果表明,在前体脂肪细胞期,各浓度组CLA均抑制前体脂肪细胞的增殖,其作用呈时间与剂量依赖的方式;在成熟脂肪细胞期,CLA可明显降低细胞内脂肪含量,CLA对脂肪细胞生脂的抑制作用亦呈剂量依赖的方式。由此说明,CLA可通过减少脂肪细胞数目及降低细胞内脂类含量来抑制脂肪细胞生脂。     

青钱柳低聚糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响

探讨青钱柳低聚糖(Cyclocarya paliurus oligosaccharide,CPO)对3T3-L1脂肪细胞增殖分化及相关基因表达的影响。采用水提醇的方法得到青钱柳初多糖,经D301-R大孔吸附树脂和DEAE纤维素阴离子交换树脂分离纯化,收集CPO作用于3T3-L1前脂肪细胞,并采用Q-PCR测定相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomes proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(CAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA表达。结果表明:CPO含有2个组分,其重均分子量分别为3 842 Da和1 481 Da;CPO在低浓度时能促进脂肪细胞的增殖,高浓度时能抑制脂肪细胞的增殖;对脂肪细胞分化的影响较小。CPO可抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表达,与对照组比较差异有极显著性意义(P0.01)。表明高浓度的CPO抑制脂肪细胞增殖分化水平,其机制可能与抑制PPARγ和C/EBPαmRNA表达有关。     

Characterization and Differentiation into Adipocytes and Myocytes of Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） could differentiate into various cell types including adipocytes and myocytes, which had important scientific significance not only in the field of tissue regeneration, but also in the field of agricultural science. In an attempt to exhibit the characterization and differentiation into adipocytes and myocytes of porcine BMSCs, we isolated and purified porcine BMSCs by red blood cell lysis method and percoll gradient centrifugation. The purified cells presented a stretched fibroblast-like phenotype when adhered to the culture plate. The results of flow cytometry analysis and immunofluorescence staining demonstrated that the isolated cells were positive for mesenchymal surface markers CD29, CD44 and negative for hematopoietic markers CD45 and the adhesion molecules CD31. Cells were induced to differentiate into adipocytes with adipogenic medium containing insulin, dexamethasone, oleate and octanoate. Oil Red O staining demonstrated that the porcine BMSCs successfully differentiated to adipocytes. Moreover, the findings of real-time PCR and Western blotting indicated that the induced cells expressed adipogenic marker genes （PPAR-y, C/EBP-c~, perilipin, aP2） mRNA or proteins （PPAR-3,, perilipin, aP2）. On the other hand, porcine BMSCs were induced into myoctyes with myogenic medium supplemented with 5-azacytidine, basic fibroblast growth factor, chick embryo extract and horse serum. Morphological observation by hochest 33342 staining showed that the induced cells presented as multi-nucleus muscular tube structure. And myogenic marker genes （Myf5, desmin） mRNA or proteins （MyfS, MyoD, myogenin, desmin） were found in the induced cells. In addition, the results of immunofluorescence staining revealed that myogenic marker （Myf5, MyoD, myogenin, desmin, S-MyHC） proteins was positive in the induced cells. Above all, these results suggested that the isolated porcine BMSCs were not only consistent with the characterization of mesenchymal stem cells, but also exhibited the multipotential capacity to form adipocytes and myocytes, which provided the basis to investigate the regulation mechanism involved in the selective differentiation of porcine BMSCs.     

猪成熟脂肪细胞产生的胰岛素抵抗与应激

 猪脂肪细胞内环境的稳定在脂类代谢过程中起着重要作用。在肥胖等疾病发生过程中,成熟脂肪细胞面临由于能量过剩、炎性反应等造成的内质网应激,导致由于脂肪细胞负荷过重而致内环境稳定的破坏,从而产生胰岛素抵抗。本文就近年来关于猪脂肪细胞应激导致胰岛素抵抗的最新研究进展进行综述,为了解成熟脂肪细胞应激与胰岛素抵抗产生的机制提供参考。     

ChREBP基因siRNA表达质粒构建及对原代 培养猪脂肪细胞生脂的影响

【目的】构建ChREBP基因siRNA表达质粒,干扰ChREBP在原代培养猪脂肪细胞的表达,研究其在葡萄糖诱导脂肪细胞生脂中的作用。【方法】合成4对靶向ChREBP基因的siRNA寡核苷酸,分别连接于pcDNA™6.2-GW/EmGFP载体构建siRNA表达质粒,测序验证后,采用脂质体介导法转染从3日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,荧光定量RT-PCR检测ChREBP基因沉默效率;以葡萄糖浓度为0—20 mmol·L-1的培养液培养转染细胞48 h,测定生脂及生脂基因表达变化。【结果】筛选出了1个转染效果好、ChREBP基因沉默效率达85%的siRNA表达质粒,转染原代培养猪脂肪细胞后,细胞生脂水平及生脂基因ACC1和FAS mRNA表达比阴性对照表达质粒转染细胞和未转染细胞显著降低（P＜0.05）,且生脂水平不受葡萄糖水平的影响（P＞0.05）。【结论】构建的siRNA表达质粒能有效干扰猪脂肪细胞ChREBP表达,葡萄糖通过转录因子ChREBP调控猪脂肪细胞生脂及生脂基因表达。     

伏马毒素B_1对猪肾上皮细胞增殖的影响

研究旨在探究伏马毒素B_1(FB_1)对猪肾上皮细胞增殖的影响,通过MTT检测FB1对PK15细胞活力和qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平。结果表明,FB1显著减少细胞活力,降低细胞核增殖抗原PCNA和周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达水平,升高P21和P27的mRNA表达水平。说明FB1可通过调控细胞周期相关基因的表达抑制猪肾上皮细胞增殖。     

红花苷对白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用

[目的]研究红花苷对K562白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用。[方法]以培养的K562白血病细胞为试验对象,通过XTT试验、集落形成试验、血红蛋白联苯胺染色试验以及形态学试验,考察红花苷对白血病细胞抑制增殖和诱导分化作用。[结果]红花苷剂量依赖性地抑制了K562白血病细胞的活性及集落形成(P0.05),形态学观察及联苯胺染色试验也证实了红花苷剂量依赖性地诱导K562白血病细胞向产生血红蛋白的终末细胞分化。[结论]红花苷对K562白血病细胞具有明显的抑制增殖和诱导分化作用。     

Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

[目的]探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物(Trolox)通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础.[方法]首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度(0、50、100和200 μmol·L-1)的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞...     

淫羊藿苷对鸡胚成骨细胞增殖和分化的影响

【研究目的】本文研究了淫羊藿苷对鸡胚成骨细胞增殖和分化的影响。【方法】将不同浓度的淫羊藿苷加入第二代成骨细胞中,分别于培养24、48、72h时,使用MTT法和PNPP法检测成骨细胞的增殖率和碱性磷酸酶(ALP)活性。【结果】淫羊藿苷促进鸡胚成骨细胞增殖和分化,但增殖作用不显著。其中当淫羊藿苷浓度为20ng/ml时,对成骨细胞增殖分化作用最强。【结论】淫羊藿苷能够显著促进鸡胚成骨细胞分化,对成骨细胞增殖有一定作用。