藏獒犬白介素18基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR技术从刺激的藏獒犬外周血淋巴细胞中成功克隆白介素18基因全长,其大小为582bp,编码194个氨基酸。与GenBank上发表的犬IL-18(NM001003305)比较,序列的同源性为100%,与犬、猫、猪,牛、羊、人的IL-18基因核苷酸同源性分别为100%、91.2%、91.1%、88.5%、89.3%、84.4%。系统进化树可以看出,藏獒犬基因与犬的亲缘关系最近,与猫的其次,与人是较远的。然后构建-IL18去信号肽的原核表达载体pET-30a-IL18,转化BL2L,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出25kd融合蛋白而且目的蛋白主要以包涵体的形式存在,westbloting验证表达的蛋白正确。     

奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达

以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。     

人SOD基因的克隆与原核表达

超氧化物歧化酶(SOD)是机体内超氧自由基的天然清除剂,在抗衰老、抗辐射、抗逆境,消炎、抑制肿瘤和癌症,以及自身免疫疾病的治疗方面有很重要的作用。我国目前主要从血液中提取SOD,有关重组人SOD的研究较少。文章通过RT-PCR方法克隆得到人SOD基因,并成功构建其原核表达载体pET-16b-SOD,为通过基因重组技术生产人SOD创造了条件。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

猪EP1基因的克隆与原核表达

为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

水貂IFN-β基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR方法克隆得到β干扰素基因(IFN-β),将IFN-β成熟肽插入原核表达栽体pET32a,在E.coli BL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白.结果表明,IFN-β片段长561 bp,与已报道的水貂IFN-β基因相比较同源性为100%,IFN-β成熟肽可编码179个氨基酸.重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子质量约为34 ku,与预期结果相符.     

水貂IFN-α基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

人瘦素基因的克隆及原核表达

为了获得大量的、可供试验研究和制作生物反应器的人瘦素蛋白,从人脂肪组织中提取总RNA,用RT-PCR法获得了编码人瘦素(leptin)167个氨基酸残基的cDNA序列,并克隆至载体pMD19-TSimple上进行序列分析。以克隆的人瘦素cDNA为模板,用特异引物扩增瘦素基因,经EcoRI和BamHI双酶切,定向插入高效原核细胞表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE检测。结果:用RT-PCR法扩增得到的cDNA片断序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank公布的人瘦素基因序列一致;SDS-PAGE分析基因表达产物,在20 ku处有一特异条带,说明重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中可表达人瘦素蛋白。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

狮头鹅PRL基因的克隆及原核表达

为了进一步研究PRL对狮头鹅繁殖性能的生理调节机制,采用RT-PCR方法从狮头鹅脑垂体组织扩增获得PRL基因的cDNA序列,克隆至pMD18-T载体获得重组质粒pMD18-PRL,并进行序列测定和分析。将测序正确的cDNA序列定向克隆到pET32a(+),构建表达载体pET32a-PRL,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western Blot分析。狮头鹅PRL基因编码区含有600个核苷酸,编码199个氨基酸(GenBank No.GQ856665),与其它禽类PRL具有高度保守性;狮头鹅PRL蛋白二级结构由多个α螺旋和β转角及无规卷曲构成,推测N端70～76、95～102、150～155和207～213区段为其抗原表位的优势区。SDS-PAGE检测表明狮头鹅PRL基因在大肠杆菌中获得了高效表达,可溶性表达产物约占全菌总蛋白的53.6%,融合蛋白分子量约41ku,并用镍柱亲和层析法分离纯化融合蛋白。Western Blot分析证实了所获的融合蛋白具有较强抗原性。试验结果为进一步研究PRL基因的生物功能及其对狮头鹅就巢、产蛋等生产性状的影响奠定了基础。     

弓形虫CDPK1-EF基因的克隆与原核表达

CDPK是一类钙依赖蛋白激酶,其可参与调控寄生虫入侵,外出宿主细胞,配子的形成及在宿主体内移行等。采用RT-PCR技术,扩增弓形虫RH株目的基因钙依赖蛋白激酶EF模体(CDPK1-EF),然后将其克隆至表达载体pET-32a,以构建重组质粒ET-32a-CDPK1-EF,经IPTG诱导目的蛋白表达,并采用Ni-NTA亲和层析法纯化,最后经SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果,成功地克隆出弓形虫CDPK1-EF基因,序列比对表明,其与GenBank报道的相关序列同源性达100%。采用SDS-PAGE技术对诱导表达蛋白以及纯化产物检测发现37 ku目的蛋白出现,与预期结果相一致。本文在国内首次成功克隆和表达弓形虫RH株CDPK1-EF基因,这为研究该基因功能及分布特征等提供了基础。     

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.     

鸡α-干扰素基因的克隆与原核表达

根据Genbank中发表鸡α-干扰素基因序列设计一对引物,采用PCR法从SPF鸡的全血白细胞中克隆了α-干扰素基因(ChIFN-α)。序列分析结果显示,与已发表的ChIFN-α的同源性在98.1%以上,与其他禽类的IFN-α同源性在67.4%以上,其中与火鸡IFN-α同源性在89.8%,而与鸭α干扰素同源性仅为67.4%。将该基因连接到原核表达载体pET-28a上,构建重组表达质粒,转入BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE分析,可见一条约19ku的清晰蛋白带,结果表明克隆的ChIFN-α基因在原核中获得表达。     

Hela细胞早孕因子基因的克隆与原核表达

为了获取大量具有免疫原性的早孕因子(EPF)重组蛋白,通过PCR技术扩增得到Hela细胞EPF基因片段,与pREST-A连接。将质粒pREST-A-EPF转化大肠埃希菌BL21后IPTG进行诱导表达,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,再用SDS-PAGE和Western blot分别鉴定其纯度和特异性。结果表明,EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pREST-A,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白,Western blot表明其与抗EPF抗体特异性结合。论文构建了EPF的原核表达载体,纯化获得了重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究和猪早孕诊断试剂盒的开发奠定了基础。     

樱桃谷鸭白介素18基因的克隆与原核表达

从鸡新城疫病毒刺激的鸭脾脏淋巴细胞培养液中提取基因组RNA，采用RT—PCR方法扩增鸭IL-18基因，插入pMD18-T载体，进行序列测定与分析。将成熟鸭IL-18基因亚克隆到表达载体PBCX中，并转化入大肠杆菌E．coliBL21进行表达。测序结果表明，该基因由603个核苷酸组成，包含一个完整阅读框，共编码201个氨基酸。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量约为59KD的融合蛋白。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增，得到了1条完整的基因，大小为642bp；测序分析证明，它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析，表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中，用IPTG进行诱导。结果证实，该基因可以在大肠杆菌中表达，表达产物为分子质量约50ku的融合蛋白，与理论推测的蛋白分子质量一致；Western—blotting试验证明，表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。