进出口动物中新霉素ELISA检测方法的建立

应用碳二亚胺法合成人工抗原得到卵清蛋白偶联新霉素,通过方阵试验确定最佳抗原包被浓度与抗体稀释倍数,以新霉素质量浓度对数为横坐标、抗体抑制率为纵坐标绘制标准曲线,建立了进出口食用动物中新霉素ELISA快速检测技术,并对建立的方法进行了回收率和特异性试验。结果表明,建立的检测方法包被人工合成抗原的最适稀释度为1：200,抗体的最佳稀释度为1：2 000,半数抑制浓度（IC₅₀）为6.99 ng/mL;该方法的最低检测限达40 ng/mL,与庆大霉素、卡那霉素、链霉素、托普霉素、阿米卡星、双氢链霉素的交叉反应率均小于0.1%,平均加标回收率83.77%。标准曲线在1.5~40 ng/mL范围内是线性的,相关系数为0.987,标准曲线方程为y=-37.66x+94.592;与常规液相检测方法相比操作简单、快速。本研究建立了一种快速、高效、特异的新霉素ELISA检测方法。     

盐酸克伦特罗在羊主要脏器中残留量消除规律的研究

本试验对盐酸克伦特罗在休药期肉羊眼睛、心脏、肾脏、肺脏、脾脏等组织中的残留规律进行了研究。选择24头体重为(30±5)kg健康肉羊进行试验,在饲料中添加50 μg/kg盐酸克伦特罗,连续饲喂35 d后休药,通过液相色谱—质谱联用/质谱检测休药期肉羊组织中克伦特罗含量,研究其残留量消除规律。试验结果表明,肉羊眼睛中有高浓度的盐酸克伦特罗残留且其在肝脏中消除较慢;停药第14天眼睛中盐酸克伦特罗的浓度仍为42.42～63.48 μg/kg,脾脏中盐酸克伦特罗消除速度是最快的;停药3 d时,检测不到盐酸克伦特罗的残留量(低于检出限0.07 μg/kg),故眼睛可用作检测盐酸克伦特罗在肉羊生产上非法使用的靶标。     

盐酸克伦特罗胶体金快速检测试纸条的研制

研制一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法的试纸条,以用于对猪尿中盐酸克伦特罗的检测。以胶体金标记盐酸克伦特罗单克隆抗体竞争性膜层析技术制成了猪尿液中盐酸克伦特罗残留检测的快速检测试纸条。如待测尿样中无盐酸克伦特罗,则金标抗体能顺利地与固相载体结合,形成肉眼可见的红色带;如待测尿样中含有盐酸克伦特罗,则与金标抗体以同样的机会与固相载体结合,竞争性地占去了金标抗体与固相载体结合的机会,使金标抗体与固相载体的结合量减少,无法形成肉眼可见的红色带。经过试验制成了可检测出猪尿样中盐酸克伦特罗浓度为2 ng/mL的试纸条,可在8 min完成测试,肉眼即可判断;该试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求,且无需任何仪器设备,具有敏感、特异、快速、简便的特点,适用于现场快速检测和筛选工作。     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR<0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R^2=0.990),其IC₅₀为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

GC/MS离子法测定猪尿中瘦肉精残留的研究及应用

GC／MS离子法测定猪尿中盐酸克伦特罗的残留，具有很好的分离度，特征离子与谱库检索一致，匹配度高。浓度10-200ng／mL范围呈良好的线性关系（R=0．9947）；仪器检出限为5—10ng／mL；回收率范围为69．7％-97．6％；批内变异系数≤6．1％。批间变异系数≤3．2％。检测60批猪尿中盐酸克伦特罗的残留。检出率为0。本方法对确证猪尿中盐酸克伦特罗残留具有重要意义。     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R~2=0.990),其IC_(50)为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

GCMS联用技术测定猪尿中盐酸克伦特罗的基质效应分析

本试验采用农业部1025号公告-16-2008方法制备出空白猪尿基质,添加一定量标样进行衍生化,使得上气相质谱分析的盐酸克伦特罗浓度分别为20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,500ng/mL。同时,直接添加同样量的盐酸克伦特罗溶液直接衍生化,使得上机浓度与前述4个浓度保持一致。用出峰时间定性,峰面积响应值定量。并用相关公式计算得到基质效应系数。结果表明:气相质谱法测定猪尿中的盐酸克伦特罗存在一定的基质效应。在试验中的5个浓度范围内,基质效应值在3.67～4.18。疑似常数。     

气相色谱串联质谱法检测饲料中的盐酸克伦特罗

盐酸克伦特罗作为一种主要的β-兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中,用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。在畜禽产品中过量残留会对消费者造成危害,因此被禁止在畜禽养殖中使用。盐酸克伦特罗在家畜与人体内吸收好,而且与其他β-兴奋相比,它的利用率高,以至食用了含有盐酸克伦特罗的猪肉出现中毒现象。由于盐酸克伦特罗通过饲料对动物的饲喂会残留在动物的肌肉与内脏组织中,对饲料中盐酸克伦特罗进行监测也就显得尤为重要。经试验,应用气相色谱串联质谱法检测饲料中盐酸克伦特罗,标准曲线r≥0.99999;变异系数(CV值)≤0.91%;检测回收率88.2%～98.2%;回收率标准偏差≤1.47%。     

化学发光免疫分析法检测猪尿中莱克多巴胺残留

本试验运用化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）检测猪尿中莱克多巴胺（Ractopamine,RAC）的残留。检测限为0.01 ng/mL,检测范围为0.036～32.2 ng/mL。添加浓度分别为0.1、1、10 ng/mL,平均回收率为73.2%,批内平均变异系数为9.7%,批间平均变异系数为11.3%。而本研究所建立的化学发光免疫检测方法(CLISA)可以达到检测RAC残留的要求。     

用HPLC-MS/MS研究动物毛发中克伦特罗的残留及代谢规律

研究建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定毛发中盐酸克伦特罗残留的方法。猪毛发以0.1moL/L盐酸溶液提取,MCX固相萃取柱净化,流动相溶解定容。以SB-C18柱为分离柱,1%乙酸水溶液和甲醇(60∶40,V∶V)作为流动相,MS/MS进行定性和定量分析。在优化条件下的最低检出限为0.05μg/kg,定量限为0.2μg/kg。毛发样品中添加不同浓度盐酸克伦特罗,测得回收率在79.0%～86.2%之间,变异系数均低于15.2%。应用该方法研究了盐酸克伦特罗在猪毛发中的代谢并初步探讨其代谢机理。结果表明:在较高饲喂浓度(10mg/kg)时,用药5d后,黑色猪毛发有少量盐酸克伦特罗残留,而白色猪毛发中未检出。从第7天起猪毛发中盐酸克伦特罗蓄积量逐渐增加,最高蓄积浓度为4852.5μg/kg。     

应用气质联用法检测饲料中盐酸克伦特罗的探讨

盐酸克伦特罗作为一种主要的β-兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中,用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。在畜禽产品中过量残留会对消费者造成危害,因此被禁止在畜禽养殖中使用。盐酸克伦特罗在家畜与人体内吸收好,而且与其他β-兴奋剂相比,它的利用率高,以致于食用了含有盐酸克伦特罗的猪肉出现中毒现象。由于盐酸克伦特罗易残留在动物的肌肉与内脏组织中,对饲料中盐酸克伦特罗进行监测显得尤为重要。经试验,应用GC-MS法检测饲料中盐酸克伦特罗,标准曲线r值≥0.99999;变异系数(CV值)≤0.91%;检测回收率:88.2%~98.2%;回收率标准偏差≤1.47%。     

高效液相色谱法测定沙咪珠利中的水合肼残留量

建立了一种沙咪珠利中水合肼残留检测的高效液相色谱法。含水合肼样品用盐酸溶液溶解后,加苯甲醛溶液衍生化,再用己烷提取,过滤后进样测定。采用Dikma Technologies Diamonsil C18色谱柱(250×4.6mm, 5μm);流动相为乙二胺四乙酸钠0.03% m/V,乙腈（300:700,V/V）;流速1mL/min;紫外检测波长268nm。该方法在5ng/mL~150ng/mL的范围内具有良好的线性关系,回归方程Y=260.35X+796.12,R2=0.9993。10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三个添加浓度的添加回收率分别为105.58%、100.21%、102.60%,RSD分别为2.66%、3.16%、2.31%。该方法精密度好,快速准确,适用于沙咪珠利样品中水合肼残留量的检测。     

气相色谱-串联质谱法测定饲料中的瘦肉精

盐酸克伦特罗也称为"瘦肉精",可作为一种主要的β-兴奋剂应用于畜禽肉制品生产中,用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。在畜禽产品中过量残留会对消费者造成危害,因此在畜禽养殖中被禁止使用。盐酸克伦特罗在家畜与人体内易吸收,而且与其它β-兴奋剂相比,它的利用率更高,以致食用了含有盐酸克伦特罗的猪肉出现中毒现象。由于盐酸克伦特罗会残留在动物的肌肉与内脏组织中,对饲料中盐酸克伦特罗进行监测也就显得尤为重要。经试验,应用GC-MS法检测饲料中盐酸克伦特罗,标准曲线r值≥0.99999;变异系数(CV值)≤0.91%;检测回收率:88.2%～98.2%;回收率标准偏差≤1.47%。     

沙丁胺醇残留的酶联免疫检测方法的建立

用自主制备的沙丁胺醇特异性抗体建立了针对沙丁胺醇残留的间接竞争酶联免疫检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性等性能进行了测定,并与高效液相色谱方法进行了对比性分析。结果显示:沙丁胺醇药物残留的间接竞争酶联免疫检测体系的检测范围为1～80ng/mL,灵敏度为0.58ng/mL,检测限为1ng/mL,回收率为70～99%,与盐酸克仑特罗、硫酸特布他林交叉反应率分别为107%、10%,与盐酸莱克多巴胺及肾上腺素的交叉反应率小于0.01%;采用HPLC方法进行沙丁胺醇药物残留的检测时,其检测范围为10μg/mL～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为80～95%。该方法与高效液相色谱法相比灵敏度较高,特异性强,检测结果准确度相近,但是在检测结果稳定性方面逊与HPLC方法。     

高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留

为了建立一种同时测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物(恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星)多残留高效液相色谱检测方法,将牛奶中的残留药物用磷酸-甲醇溶液重复提取2次,正己烷除去脂肪净化后浓缩,流动相溶解后用高效液相色谱-荧光检测器测定。结果表明,4种氟喹诺酮类药物在0.01~1.00μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(R=0.999 9),在0.01,0.05,0.10,0.50μg/mL和1.00μg/mL 5个浓度添加水平上,平均回收率为77%~93%,样品的批内和批间变异系数均值分别为5.29%和7.83%,定量限均为10 ng/mL。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星检测限均为5 ng/mL,二氟沙星检测限为8 ng/mL。本研究建立的检测方法简单、快速、灵敏度和回收率高,适用于牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留检测。     

培氟沙星间接竞争ELISA检测方法的建立

为了建立培氟沙星(PFLX)残留含量的间接竞争ELISA快速测定法(ci-ELISA),试验采用人工合成的培氟沙星-卵清白蛋白偶联物(PFLX-OVA)为检测抗原,PFLX标准品为竞争半抗原,与一定量的PFLX进行抗血清竞争反应。结果表明:理想的包被抗原质量浓度为0.25μg/mL,PFLX抗血清稀释倍数为1∶16 000,得到回归方程(y=-18.298x+93.374,R2=0.991)和标准曲线,最小检测量为28.77 ng/mL,在0.5～2 000 ng/mL范围内样品添加回收率为89.07%。说明所建立的检测方法可以用于培氟沙星残留含量的快速测定。     

检测莱克多巴胺胶体金免疫层析试验的建立

采用混合酸酐法制备莱克多巴胺-OVA偶联抗原,胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体,建立了检测莱克多巴胺的胶体金免疫层析试验。该试验具有较好的敏感性和特异性,最低可检测10ng/mL的莱克多巴胺,而与克伦特罗和沙丁醇胺无交叉反应。胶体金免疫层析试验对尿液和饲料样品中莱克多巴胺的最低检测量分别为10ng/mL和0.01mg/kg。     

高效液相色谱-串联质谱法测定莱芜香肠中3种β-受体激动剂残留

为建立一种快速测定莱芜香肠中盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等3种β-受体激动剂残留量的液质联用检测方法,将样品加入乙酸铵溶液,经β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶水解以及固相萃取柱净化后,以甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾离子源,以多反应监测方式进行采集,外标法定量。结果显示,3种β-受体激动剂在0.5～50.0 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.999 6);该方法检出限均为0.25μg/kg,平均回收率为90%～110%,相对标准偏差为0.1%～2.0%。该方法优化了盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的仪器分析条件,操作方便、结果准确、重现性好、回收率高,能满足莱芜香肠中食品安全控制检测的需要。     

ELISA方法检测猪尿中克伦特罗的方法验证

为了验证ELISA方法检测猪尿中克伦特罗残留量的可行性,采用ELISA方法对试剂盒的校正曲线的线性相关关系、检测限、重复性和样品加标回收率进行了验证.结果为,试剂盒的校正曲线的线性相关系数为0.985;定性检出限为0.147ng/mL,定量检出限为0.490ng/mL;添加0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL的克伦特罗标准液时,变异系数分别为2.29%、6.97%、2.73%,平均回收率分别为91.8%、102.4%、99.7%.结果表明应用ELISA方法检测猪尿中克伦特罗残留量符合实验室质量控制规范的要求,适合检测猪尿中克伦特罗残留量的初筛.     

3种ELISA试剂盒检测盐酸克伦特罗效果评价

用3种盐酸克伦特罗ELISA检测试剂盒对10份未知猪尿液样品及5份标准浓度猪尿液样品进行检测,以比较试剂盒的检测效果。结果表明,试剂盒A在盐酸克伦特罗浓度为0ng／mL-10ng／mL的范围内其检测结果较准确,当浓度大于10ng／mL时其检测结果偏小;试剂盒B对盐酸克伦特罗的检测结果较标准样品浓度有时偏高,有时偏低,结果不够准确;试剂盒C的检测结果与标准样品的实际浓度相近,结果较准确。稳定性方面,试剂盒B的稳定性差,而试剂盒A及试剂盒C的稳定性较好。总的来说,试剂盒C在检测结果的准确性和稳定性上均较好,是3种试剂盒中效果最为理想的盐酸克伦特罗检测试剂盒。