共焦激光扫描显微镜技术

共焦激光扫描显微镜技术常国权，刘畅（长春农牧大学中心实验室，长春１３００６２）共焦激光扫描显微镜技术（简称共焦显微术）是８０年代后期发展起来的一项新的显微镜技术。［１］。共焦激光扫描显微镜（ｃｏｎｆｏｃａｌｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐ...     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。     

柴胡皂甙D通过非mTOR依赖途径诱导HeLa细胞自噬

为了研究柴胡皂甙D能否诱导HeLa细胞发生自噬,并初步探讨其机制,试验采用激光共聚焦显微镜、免疫印记等技术评价经柴胡皂甙D处理后的HeLa细胞的自噬水平。结果表明:经柴胡皂甙D处理后,激光共聚焦显微镜观察到GFP-LC3斑点显著增加;柴胡皂甙D能显著增加LC3-Ⅱ的表达;但自噬关键蛋白mTOR没有变化。说明柴胡皂甙D能诱导HeLa细胞发生自噬,并通过非mTOR依赖途径。     

蕨麻多糖对小鼠脾脏淋巴细胞NADPH氧化酶活性的影响

为探讨蕨麻多糖对体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞NADPH氧化酶活性的影响,作者应用超氧阴离子荧光探针HE标记脾脏淋巴细胞后,借助激光扫描共聚焦显微镜,对脾淋巴细胞内HE荧光强度的变化进行了检测。结果经H2O2诱导处理的脾细胞中NADPH氧化酶活性显著降低,蕨麻多糖能使脾淋巴细胞内荧光强度增强。表明蕨麻多糖(PAP)能够拮抗由H2O2引起的酶活性降低,促进细胞NADPH氧化酶的活性的恢复,从而影响免疫细胞呼吸爆发功能。     

胚兔牙囊发育生物行为的组织形态学观察

研究胚兔的牙囊发育生物行为与人的牙囊发育是否相似，为人口腔疾病的研究提供模拟实验动物模型，采用光镜、电镜及激光扫描共聚焦显微镜对43只胚兔的牙囊发育过程进行形态学观察。结果显示，牙囊来源于外胚间质，通过胚胎诱导形成牙支持组织，分化产生成牙骨质细胞、成骨细胞、成纤维细胞，形成牙骨质、固有牙槽骨、牙周韧带及其基质，对牙齿发育阶段具有保护和稳定作用，调控未来形成的牙周结构，在早期发育阶段首先出现，与人牙囊发育基本相似；最终牙囊在牙冠的顶部形成索引带，诱导继承牙萌出，在牙冠的根部形成牙支持组织，一部分牙囊细胞有程序性细胞死亡，以维持牙囊发育期内环境的生理平衡。     

Asia 1型口蹄疫病毒前导蛋白（L^pro）亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白（Lpro）亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L。利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶（PI）染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位。结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDV L基因在BHK-21细胞中得到表达;Western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布。     

Asia1型口蹄疫病毒前导蛋白(Lpro)亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)前导蛋白(Lpro)亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L.利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting.方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶(PI)染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位.结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDVL基因在BHK-21细胞中得到表达;western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布.     

胚兔牙乳头发育生物行为的观察

为阐明胚兔牙胚在发育中外胚、外胚间质的相互诱导，利用光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜及特殊染色方法，观察了胚兔15～29d发育阶段牙乳头细胞形态学的改变。结果表明，牙胚蕾状期牙乳头尚未分化；帽状期间质细胞增生形成牙乳头，在外胚成釉器细胞的诱导下形成牙乳头，即牙髓和牙本质形成的器官；钟状期，牙乳头为成釉器包围，牙乳头边缘部的间质细胞在外胚成釉器细胞的诱导下分化为成牙本质细胞，未来形成冠、根部牙本质；牙乳头内部则形成未分化的间质细胞，继而分化为牙髓细胞及其基质。牙乳头发育过程中外胚与外胚间质相互诱导；牙乳头在细胞分化过程中有的细胞分裂与细胞程序性死亡并存，对未来决定牙齿的形态和维持牙齿组织内环境的稳定具有重要作用。     

镉对鸡胚成纤维细胞增殖和凋亡的影响

以鸡胚成纤维细胞为研究对象,探讨镉影响细胞增殖及凋亡的作用。应用酶标仪、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪,分析细胞毒性、细胞形态、凋亡率、细胞周期与线粒体膜电位及胞内钙离子稳态。结果表明:镉处理后,细胞活性下降,呈现凋亡形态学变化,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率呈浓度和时间依赖性,细胞线粒体膜电位下降,胞内游离钙离子浓度增大。研究发现,镉可通过阻滞细胞周期,降低线粒体膜电位,影响胞内钙离子稳态来诱导鸡胚成纤维细胞凋亡。     

弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶真核表达载体构建及在Vero细胞内的定位分析

为研究弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶(PKAR)基因在Vero细胞内的定位情况,本研究构建弓形虫TgPKAR-RFP-C2真核表达质粒,并将其真核转染至Vero细胞内。试验中利用PKAR基因序列设计引物,以反转录获得的cDNA模板进行PCR扩增,成功获得目的片段,并构建克隆质粒pMD-PKAR。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后构建真核表达质粒PKAR-RFP-C2,利用脂质体转染法将其导至Vero细胞内,利用Leica激光共聚焦显微镜观察PKAR基因在Vero细胞内的表达情况及其定位。结果显示,成功获得了PKAR基因,与GenBank公布的基因序列相似性为100%,并成功构建真核表达质粒及在Vero细胞内表达。Western blot试验成功检测到目的条带;激光共聚焦显微镜观察发现PKAR基因主要在Vero细胞的细胞质中呈点状表达。结果为进一步研究PKAR基因生物学功能及核酸疫苗研制奠定基础。     

铬诱导鸡胚成纤维细胞凋亡作用研究

为探讨铬对鸡胚成纤维细胞的凋亡作用,以鸡胚成纤维细胞为研究材料,应用酶标仪、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪,分析细胞毒性、细胞形态、凋亡率、细胞周期、线粒体膜电位、胞内钙离子稳态及活性氧水平。结果显示:0.5、1.0和2.0μmol/L CrCl_3促使细胞活性下降、呈现凋亡形态学变化,细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率呈时间-剂量依赖性,细胞线粒体膜电位下降,胞内游离钙离子浓度增大,胞内活性氧增多。铬可通过影响细胞周期进程,降低线粒体膜电位,干扰胞内钙离子稳态,氧化损伤来诱导鸡胚成纤维细胞凋亡。     

咪唑诱导的人子宫内膜癌细胞HEC-1B空泡化现象研究

咪唑作为一种弱碱性物质,处理动物子宫内膜细胞后,可诱导其产生空泡化现象,进而影响其生殖生理功能。本研究使用人子宫内膜癌细胞HEC-1B作为模型,使用咪唑处理导致细胞空泡化后探讨空泡化产生的生理机制。通过基因芯片分析、荧光定量PCR检测、激光共聚焦显微镜观察等方法进行研究。结果表明:咪唑处理人子宫内膜癌细胞HEC-1B后,空泡型质子泵(V-ATPase)亚基V0D2基因表达量上调。使用荧光定量PCR验证芯片结果,V-ATPase亚基V0D2 mRNA表达量有所上调。对V-ATPase另外一个亚基V1E1基因进行荧光定量PCR,其mRNA表达量也有所上调。使用V-ATPase抑制剂巴弗洛霉素A1和咪唑共同处理人子宫内膜癌细胞HEC-1B后,通过吖啶橙染色,激光共聚焦显微镜观察,咪唑诱导的空泡被显著抑制。上述结果证明了V-ATPase在咪唑诱导的细胞空泡化中的重要作用。     

CAML蛋白对流感病毒复制调控机制的初步研究

为探究宿主因子钙离子信号调节亲环素配体(CAML)调控流感病毒复制的机制,本研究通过siRNA干扰技术下调CAML的表达后,利用病毒蚀斑试验检测CAML对流感病毒复制的影响,利用激光共聚焦显微镜观察CAML对流感病毒NP蛋白入核的影响,通过流式细胞仪检测CAML对流感病毒诱导的细胞凋亡的影响.瞬时过表达CAML后,利用...     

骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响

拟研究骨碎补总黄酮对缺氧环境中犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.运用骨碎补总黄酮(TFDR)干预低氧浓度(10％)环境中犬BMSCs 4周后诱导成骨分化,倒置显微镜观察茜素红染色BMSCs钙结节形成,比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性水平,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位,激光共聚焦显微镜和RT-PCR...     

应用ViewRNA技术特异性检测感染细胞中的不同马传染性贫血病毒株

为了对体外培养细胞感染的不同马传染性贫血病毒(EIAV)株进行特异的鉴别检测,本研究基于一种新的RNA原位杂交-ViewRNA技术,通过设计合成针对EIAVFDDV13和EIAVUK3病毒株基因组RNA的特异性探针,并结合信号放大技术和荧光标记技术,同时通过激光共聚焦显微镜进行观察,建立了可时两种不同株的EIAV基因组RNA进行细胞内原位检测的方法.研究结果表明,两组探针能够特异地与感染细胞中EIAVFDD13和EIAVUK3的病毒RNA相结合,可在两种不同EIAV株共感染的宿主细胞中实现对两种毒株的有效鉴别和定位检测.该方法为进一步研究EIAV与宿主细胞间相互作用提供了有效手段.     

奶牛MC4R基因真核表达载体的构建及其表达定位

奶牛黑素皮质素受体-4(MC4R)基因作为G蛋白偶联受体,是关系经济性状的重要候选基因。本研究从牛基因组中克隆得到MC4R基因的编码序列,将克隆片段与pc DNA3.1真核表达载体进行KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接形成重组表达载体,将载体瞬时转染到L02肝脏细胞,采用免疫荧光对细胞进行标记,通过激光共聚焦显微镜观察荧光活性,结果发现克隆的MC4R基因序列长度大约1 000 bp,成功构建真核表达载体MC4R-3.1,将载体转染肝脏细胞后Western blot检测蛋白表达,经过激光共聚焦观察荧光后发现MC4R蛋白的绿色荧光在细胞膜上有正常表达,可为进一步研究MC4R受体基因功能提供参考。     

噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞穿透肽

为辅助抗菌药物进入动物细胞杀伤胞内致病菌，本试验利用噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞的穿透肽。通过噬菌体展示技术进行4轮体外生物淘洗，得到与猪小肠上皮细胞结合的多肽；经过4轮减数筛选，噬菌体回收率逐渐提高，酶联免疫吸附法（ELISA）测定单克隆噬菌体对猪小肠上皮细胞的亲和力，亲和力≥2的为阳性，将阳性噬菌体克隆提取DNA，将高重复率序列合成细胞穿透肽，同时合成与其氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽，荧光FITC标签连接。检测多肽的抑菌活性、溶血活性和细胞毒性，荧光显微镜观察穿透肽的穿透性、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及强度。结果表明：4轮筛选噬菌体的回收率增长283倍；ELISA检测显示，随机挑选30个单克隆噬菌体，17个为阳性克隆；DNA测序得到2条高重复序列，SAYKMMA命名ICPP1和SSSISGL命名ICPP2；穿透肽及对照多肽无抑菌活性，溶血性较好，安全无毒对细胞活力无影响；荧光显微镜观察及激光共聚焦结果表明，ICPP1和ICPP2可穿透猪小肠上皮细胞膜，且ICPP1表现出更强的穿透性；流式细胞仪结果显示，ICPP1的胞内平均荧光强度明显高于...     

鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的研制及亚细胞定位

以鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)为免疫原,以DTMUV NS1原核表达蛋白为筛选抗原,获得2株针对DTMUV NS1蛋白的单克隆抗体,并进行NS1蛋白的亚细胞定位。首先,采用DTMUV脑内接种方式免疫BALB/c小鼠3～4次,取BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,通过间接ELISA法筛选NS1蛋白的单克隆抗体,并通过Western blot进行鉴定。其次,DTMUV感染BHK-21细胞24 h,加入获得的NS1蛋白单抗,结合TMUV感染细胞过程中产生的NS1蛋白,加入FITC标记山羊抗小鼠IgG反应,DAPI核染色,通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光的位置,确定NS1蛋白的亚细胞定位。结果显示,间接ELISA法筛选到2株针对NS1蛋白的杂交瘤细胞株,细胞上清和小鼠腹水抗体滴度高,敏感性强。Western blot鉴定2株杂交瘤分泌的单克隆抗体特异性强。激光共聚焦显微镜观察显示,代表NS1蛋白的绿色荧光主要位于BHK21的细胞质中,这与软件预测结果一致。结果表明,TMUV NS1蛋白亚细胞定位的明确,为进一步理解和揭示该蛋白的结构与功能,蛋白质之...     

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主细胞核仁素蛋白相互作用

为鉴定猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)与宿主细胞核仁素(NCL)蛋白的相互作用,本研究将重组质粒p EGFP-CSFV-C转染至猪睾丸细胞(ST)中,采用GST pull-down和免疫共沉淀方法沉淀ST细胞中的NCL蛋白,通过共聚焦显微镜分析C蛋白和NCL蛋白的共定位情况。结果表明,CSFV C蛋白与NCL蛋白在核仁中存在共定位现象,并且在体外和转染细胞中均存在相互作用。NCL蛋白被抑制后,CSFV的复制能力下降。本研究为进一步分析C蛋白核转运机制以及在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据。