绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

一株绵羊痘病毒的分离鉴定

对黑龙江省齐齐哈尔地区疑似羊痘病毒(CaPV)感染的病例通过临床症状进行初诊后,采集病羊皮肤丘疹、脓疱等病料,接种于牛肾细胞(MBDK),盲传5代,观察细胞病变情况;同时将病料接种于9日龄鸡胚的绒毛尿囊膜,观察鸡胚病变情况;利用PCR方法扩增病毒的P32基因;扩增产物经测序后构建系统进化树。结果:细胞出现规律而明显的细胞病变;鸡胚绒毛尿囊膜观察到特征性痘斑;扩增的P32基因片段长度为972 bp;系统进化树结果显示本研究分离的CaPV与其他绵羊痘病毒(SPPV)聚集在一个分支,证明该病毒为SPPV。     

江苏地区2株山羊痘病毒的分离与鉴定

为对江苏部分地区羊场羊痘病毒进行有效的监测和防控,及时了解病毒遗传进化趋势,降低规模化养羊业的风险,本研究从江苏部分地区养羊场采集疑似羊痘病羊的皮肤丘疹、水疱或脓疱组织病料样品,分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜、胎羊睾丸细胞(LT)和牛肾细胞(MDBK),观察鸡胚病变和细胞病变情况。同时通过PCR方法扩增羊痘病毒p32基因进行序列分析,并进行p32基因限制性片段长度多态性分析。结果显示,接种鸡胚绒毛尿囊膜形成典型的痘斑,胚体出血;系统进化分析显示,两株分离株属于山羊痘病毒(GTPV);限制性片段长度多态性分析结果也显示符合GTPV的特征。本研究所分离到的2株GTPV,为当地制定山羊痘的防控策略提供依据。     

山羊痘病毒的分离与鉴定

对贵州省2002年以来发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒的分离与鉴定。取山羊痘病羊的皮肤痘疹和水疱作待检病料,接种BHK-21传代细胞盲传3代后,出现了明显的、规律的细胞病变(CPE),病毒细胞培养物在F4代以后,能与山羊痘标准阳性血清在琼脂扩散试验中出现白色沉淀线,而与正常细胞的培养物及PBS不出现沉淀线;参照GenBank上山羊痘病毒P32基因序列,设计了1对特异性引物,对现场分离毒株进行PCR扩增,可扩增出963bp特异性的DNA条带。用待检病料感染的BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜,随着传代次数的增加,痘斑病变的出现率从13.3%～20%上升至33.3%～40%;用山羊痘病变皮肤、鸡胚绒毛尿囊膜和感染细胞进行超薄切片,在电子显微镜下可以观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

海北白藏羊羊痘病毒感染的诊断与病毒分离鉴定

青海省门源县麻莲乡瓜拉村某白藏羊个体养殖户部分2~3月龄羊突然发病,发病羊呼吸困难、持续高热、全身皮肤出现痘疹和水疱,经临床和实验室诊断,确诊为羊痘病毒感染。对病原进行分离与鉴定:取病羊的皮肤痘疹和水疱接种绵羊睾丸细胞出现了明显的、规律的细胞病变,该分离毒株的TCID50为105.1/0.1 m L,能被羊痘病毒阳性血清所抑制,其核苷酸序列与Gen Bank上登录的绵羊痘病毒同源性高达99.6%。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

绵羊痘病毒的分离与鉴定

利用羔羊睾丸细胞、Marc-145、Vero细胞对病毒进行分离和培养,通过动物回归试验、组织病理学切片的观察、透射电镜观察、PCR鉴定等方法进行病毒的鉴定,并参照GenBank中绵羊痘病毒P32基因序列设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的P32基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行同源性比对分析。结果显示:透射电镜下观察到典型的痘病毒粒子;动物回归试验中试验动物临床症状为典型的羊痘症状;组织病理学切片中观察到羊痘病毒嗜酸性包涵体;通过DNASTAR与参考毒株进行同源性比对,与参考株同源性为97.2%~99.5%。结果表明:该分离株为绵羊痘病毒,并命名为SPPV-NeiMengG2015。     

山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104 PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

山羊痘云南流行毒株的分离鉴定及P32基因PCR-RFLP分析

应用牛睾丸细胞,从12份采集自云南省不同疫点的山羊痘病羊肺脏中分离获得3株可疑毒株.这3株流行毒株经本动物回归试验、PCR鉴定及P32基因PCR-RFLP分析后确诊为山羊痘病毒,并据分离地被命名为MYS、XW、XD毒株.     

小尾寒羊绵羊痘病例的诊断

旨在对甘肃某羊场小尾寒羊疑似绵羊痘进行确诊,并深入探讨其病理变化特点.对临诊疑似患绵羊痘的小尾寒羊进行了羊痘间接ELISA抗体检测和PCR检测确诊,并对6只病羊进行病理剖检、病理组织学和超微结构研究.结果如下:羊痘间接ELISA抗体检测显示6例病羊样品均为阳性;同时,对2例病羊样品进行PCR检测,均扩增出绵羊痘病毒(S...     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×10~4PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立

比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。     

携带小反刍兽疫病毒H基因的重组山羊痘病毒构建和鉴定

将小反刍兽疫病(PPRV)毒糖蛋白基因H插入到山羊痘病(GPV)毒通用转移载体PtkPgpt-egfpP启动子P7.5的下游,构建了重组山羊痘病毒转移载体PtkPgpt-egfpPpprv-H。该重组转移载体转染感染山羊痘病毒疫苗株的绵羊睾丸细胞中,通过同源重组获得小反刍兽疫病毒H基因重组山羊痘病毒,通过纯化和PCR鉴定,证明小反刍兽疫病毒H基因插入到山羊痘病毒基因组中。本研究为进一步研究PPRVH基因重组山羊痘病毒的免疫原性奠定了基础。     

绵羊感染伪狂犬病的病理学观察与病毒分离鉴定

为了确诊1例疑似绵羊伪狂犬病病例,本试验以上海郊区某羊场发病绵羊的病料为研究对象进行了病理学观察、病毒分离和鉴定。病理组织学变化显示,发病羊大脑组织神经元发生广泛性变性、坏死并伴有嗜神经现象,神经元周围出现胶质细胞增生。病料接种BHK-21细胞,细胞出现病变,间接免疫荧光试验和荧光定量PCR检测结果证实所分离的病毒为伪狂犬病病毒。流行病学调查结果表明,绵羊伪狂犬病可能是由猪伪狂犬病病毒感染引起的。通过免疫接种猪伪狂犬病弱毒疫苗,绵羊伪狂犬病疫情得到及时控制。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

西藏绵羊溶血性曼氏杆菌分离鉴定及药敏特性研究

为探究西藏自治区山南市某地农户饲养的绵羊大批死亡的原因,采集病死羊心脏、脾脏、小肠、肺脏、气管等病料,进行细菌培养、分离鉴定、PCR检测、血清型鉴定、毒力基因检测及药敏特性分析。结果显示:从病死羊肺脏病料中分离出一株溶血性曼氏杆菌,血清型为2型;特异性PCR检测为阳性,证明分离菌株为溶血性曼氏杆菌;药敏试验结果显示,分离的溶血性曼氏杆菌对大多数临床常用抗生素敏感;主要毒力基因lktA检测为阳性。该研究首次从西藏绵羊分离出溶血性曼氏杆菌,并研究了其药敏特性,为该病的诊断与治疗提供了参考。     

山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定

为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果 PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp~837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。     

江苏部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学检测

根据猪圆环病毒2型（PCV2）基因序列,设计1对特异性PCV2的鉴定引物,利用PCR方法对65份疑似PCV2感染的病料进行检测。PCR检测为阳性的病料经处理后,接种无PCV污染的Dulac细胞进行间接免疫荧光检测。对各分离毒株的全基因组进行PCR扩增、测序和基因型分析。结果表明：共分离鉴定21株PCV2,均属2b基因型,其中有16株为1C群,5株为1A/1B群。研究显示PCV2b 1C群已在江苏成为流行毒株。     

绵羊痘病毒的检测与遗传进化分析

羊痘是全球最严重的动物传染性痘病。近年来,羊痘病毒在非洲北部和中部、中东、亚洲大部分地区广泛流行,给养殖业带来巨大的经济损失。论文对4只疑似羊痘病毒感染绵羊进行诊断,通过临床观察,病理剖检,病理组织学观察,实验室检测,确定该病为绵羊痘,并对分离的病毒主要基因进行PCR扩增及遗传进化分析,发现此毒株属于亚洲系,且我国流行株基因比较稳定,变异不大。这不仅为绵羊痘病的诊断提供了技术手段,还丰富了我国羊痘病毒感染的流行病学资料,为进一步研究羊痘病毒的变异等提供数据支持。