陆川猪肌细胞生成素基因的克隆及序列分析

为了获得广西陆川猪肌细胞生成素(MyoG)基因编码区序列(CDS),试验采集11月龄陆川猪背最长肌,提取其总RNA并反转录c DNA,通过RT-PCR方法扩增出MyoG基因CDS,纯化、回收扩增产物,与p MD18-T载体进行连接,并与大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化,将含有重组质粒的菌液送到生物公司测定序列,最后用生物软件进行序列分析。结果表明:成功扩增获得了广西陆川猪MyoG基因CDS长度675 bp,与Gen Bank报道的野猪同源性达到99.9%,与藏猪同源性为99.6%,与五指山猪、延安猪、荣昌猪、梅山猪的同源性为99.6%以上。与其他猪CDS相比较发现,陆川猪MyoG基因CDS第642位点存在T→C,并发现碱基C是其特有的,但是没有导致氨基酸突变。构建MyoG基因系统进化树,与陆川猪遗传距离最近的是藏猪,最远是褐家鼠。陆川猪MyoG蛋白质二级结构包含1个环、2个螺旋。说明猪MyoG基因高度保守,今后在进行陆川猪肌肉生长发育的研究中,可将MyoG基因作为主要候选基因之一。     

陆川猪激素敏感性脂肪酶基因的克隆及序列分析

为了获得广西陆川猪激素敏感性脂肪酶(HSL)基因编码区序列(CDS),试验从11月龄陆川猪背最长肌组织中提取总RNA,利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增出HSL基因CDS。结果表明:成功分段克隆出陆川猪HSL基因CDS,拼接后长度为2 295 bp,与Gen Bank数据库中公布的国内地方猪种梅山猪的同源性为99.9%,与外来猪种长白猪的同源性为99.7%,并发现其1 044位点存在C→T,其碱基T是陆川猪所特有,尚未导致氨基酸突变。利用生物软件构建系统进化树显示,与广西陆川猪遗传距离最近的是梅山猪,它们聚为同一支,最远的是人。陆川猪HSL基因的二级结构包含α-螺旋、β-折叠。     

陆川猪H-FABP基因克隆与序列分析

为了研究心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因与陆川猪肌内脂肪沉积的相关性,寻找猪脂肪沉积的主要候选基因,试验对陆川猪H-FABP基因进行了克隆与序列分析,参照Gen Bank已经公布的猪H-FABP基因序列(EF619344)设计引物,扩增克隆了陆川猪H-FABP基因的编码区序列,并应用DNAStar、Prot Scale等生物软件对其进行了序列分析和蛋白质二级结构预测。结果表明:陆川猪H-FABP基因编码区全长402 bp,编码133个氨基酸,碱基序列在235位点由A突变为G,并引起相应氨基酸由精氨酸转变为甘氨酸。其与野猪的亲缘关系最近,碱基同源性为99.3%;与人类、绵羊和家牛的碱基同源性也在90%以上。陆川猪H-FABP成熟肽包含有25.56%的α螺旋、12.03%的β转角、25.56%的无规卷曲和36.84%的延长线。说明H-FABP基因可作为研究陆川猪脂肪沉积的候选基因之一。     

陆川猪FTO基因的克隆及生物信息学分析

为了获得广西陆川猪肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS),试验利用基因克隆技术,从陆川猪背最长肌组织中提取总RNA,扩增出FTO基因CDS,并运用Lasergene 7.0、ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@在线蛋白分析系统和SWISS-MODEL在线分析预测系统等分析软件对扩增出的序列进行生物信息学分析。结果表明:通过克隆测序得到的陆川猪FTO基因CDS全长为1 518 bp,与GenBank中公布的乌金猪FTO基因CDS的同源性为99.9%,与苏钟猪FTO基因CDS的同源性为99.6%;陆川猪存在第1 050位点的C→G,碱基G为陆川猪所特有,导致天冬氨酸突变为谷氨酸;通过建立系统进化树发现,陆川猪与乌金猪的遗传距离最近,它们聚为一支;陆川猪FTO氨基酸组成中亮氨酸含量最高,占总氨基酸的比例为11.7%,FTO蛋白具有较强的亲水性;陆川猪FTO蛋白的二级、三级结构预测显示包含α-螺旋、无规则卷曲和延伸链。说明陆川猪FTO基因具有高度的保守性,今后在陆川猪脂肪沉积研究中, FTO基因可作为主要候选基因之一。     

苏太猪源TTP基因的克隆及其遗传进化分析

为了分析苏太猪源Tristetraproin(TTP)基因CDS序列和遗传进化关系,试验根据Gen Bank公布的野猪源TTP基因设计1对特异性引物,通过RT-PCR从苏太猪血液中扩增出TTP基因CDS区,并进行克隆和遗传进化分析。结果:扩增所得的TTP基因CDS长度为981 bp,共编码326个氨基酸。同源性分析表明:该基因核苷酸编码序列同源性与Gen Bank中公布的野猪源TTP基因一致性最高,为99.8%。系统进化树显示:该基因与野猪源TTP基因在遗传进化树上位于同一分支,亲缘关系最近;与白鱀豚、虎鲸的亲缘关系最远。     

陆川猪HSP27基因的克隆与序列分析

为了研究陆川猪HSP27基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR和克隆方法,扩增了HSP27基因的编码区序列,并进行了测序和序列分析及其蛋白质结构预测。结果表明:陆川猪HSP27基因编码区全长624 bp,编码207个氨基酸;与Gen Bank中已发表的猪HSP27基因序列相比,核苷酸有1个位点发生碱基突变,但并未引起相应氨基酸的改变;陆川猪HSP27成熟肽包含α螺旋、β转角、延长线和无规卷曲;陆川猪HSP27基因与野猪的亲缘关系最近。     

陆川猪Myf5基因克隆及其在背最长肌中发育性变化表达研究

为了获得广西陆川猪生肌调节因子(Myf5)基因编码区序列(CDS),并探讨该基因在陆川猪背最长肌中的发育性表达情况,试验以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,克隆获得Myf5基因CDS,运用生物信息学软件进行测序及分析,并利用实时荧光定量PCR技术检测30,150,180,240,300日龄陆川猪背最长肌中Myf5基因的相对表达量。结果表明:试验克隆得到的陆川猪Myf5基因CDS全长为768 bp;与GenBank上公布的香猪(KC456667.1)Myf5基因CDS的同源性为99.6%;陆川猪存在第205位点的C→A,导致亮氨酸突变为蛋氨酸;广西陆川猪与香猪的遗传距离最近,它们聚为同一支;陆川猪Myf5蛋白氨基酸组成中丝氨酸含量最高,占氨基酸总数的13.7%;Myf5蛋白具有较强的亲水性,其蛋白高级结构包含α-螺旋、延伸链和无规则卷曲;陆川猪背最长肌Myf5基因相对表达量表现为30日龄时最高,在30～240日龄呈下降趋势,240～300日龄呈上升趋势。     

陆川猪PTTG1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆陆川猪PTTG1基因全长CDS序列并对其进行生物信息学分析。利用GenBank公布的猪PTTG1预测序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学软件分析和预测了陆川猪PTTG1基因的理化性质与二级结构。结果表明,陆川猪PTTG1基因全长CDS序列为609 bp,编码202个氨基酸;其核苷酸序列与牛、黑猩猩、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼相对应序列同源性分别为90.15%、87.85%、87.52%、87.03%、76.03%、74.38%、55.74%和44.48%;PTTG1基因编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,存在16个磷酸化位点。氨基酸系统进化树分析表明,不同物种PTTG1基因在进化过程中具有高度保守性。本研究成功克隆了陆川猪PTTG1基因,为今后研究PTTG1基因在猪早期胚胎发育过程中的作用奠定理论基础。     

藏猪与大约克夏猪Mx1基因CDS区多态性及生物信息学分析

为了解藏猪与大约克夏猪Mx1基因编码序列(coding sequence, CDS)多态性,试验选择健康的成年(180日龄以上)大约克夏猪20头和藏猪30头为试验动物,采用PCR法扩增两个猪群的Mx1基因CDS区,测序分析其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs),采用生物信息学方法分析Mx1基因CDS区编码蛋白质的理化性质、疏水性、磷酸化位点、二级结构、三级结构和与其他蛋白质的相互作用,分析SNPs位点对Mx1基因编码蛋白的上述指标的影响。结果表明：在藏猪Mx1基因CDS区存在C867G、A923C、A1241G和C1324A 4个SNP位点,在大约克夏猪中存在A1241G和C1324A 2个SNP位点;其中C867G、A923C和A1241G位点属于错义突变,分别使第289位由天冬氨酸变为谷氨酸,第308位由谷氨酸变为丙氨酸,第414位由赖氨酸变为精氨酸;C1324A为同义突变。Mx1基因CDS区共编码663个氨基酸,编码蛋白质呈酸性、亲水性,二级结构以α螺旋为主;共有55个磷酸化位点,其中有37个丝氨酸(Ser)磷酸化位点,13...     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区(CDS)序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列(登录号:NM_001163647.2)设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高(9.2%),在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域:MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

陆川猪PLIN5基因的克隆和序列分析

为了研究陆川猪背最长肌围脂滴蛋白5(PLIN5,Perilipin5)基因的结构和功能,试验对陆川猪PLIN5基因进行RT-PCR扩增,所得产物经转化获得含目的基因的重组质粒pMD19-T-PLIN5,经菌落PCR扩增和测序鉴定正确后利用生物信息学方法对陆川猪PLIN5基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析,并探讨了陆川猪与其他物种PLIN5氨基酸序列的进化关系。结果表明:PLIN5基因编码区(CDS)序列长度为1 377 bp,编码458个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PLIN5基因序列中的编码区存在4个碱基差异,均为错义突变;陆川猪PLIN5蛋白不存在信号肽,没有跨膜结构域,不存在N糖基化位点;二级结构中α-螺旋占47.16%,无规则卷曲占43.67%,延伸链占9.17%;陆川猪PLIN5基因在不同物种及进化过程中具有较高的保守性,该基因编码的蛋白符合一般Perilipin超家族的结构特征。     

鸽MX基因的克隆及序列分析

本实验利用干扰素诱导剂Poly(I:C)诱导鸽成纤维细胞,提取细胞总RNA,根据Gen Bank中公布的鸽基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增白卡奴鸽MX基因全长编码区序列。结果表明:白卡奴鸽MX基因编码区长2 106 bp,编码701个氨基酸残基,推测蛋白分子量大小为79.7 ku,等电点为6.37;通过与Gen Bank中已登录的脊椎动物MX基因序列对比,核苷酸序列的同源性为54.0%~78.0%,氨基酸序列的同源性为41.3%~69.3%。本实验成功克隆了白卡奴鸽MX基因,证实其编码的蛋白具有脊椎动物MX基因共有的结构特征,为进一步研究白卡奴鸽MX基因的抗病活性及其作用机制奠定了基础。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

羊口疮病毒湖北株F1L基因克隆与遗传进化分析

为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)F1L基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的ORFV-F1L基因序列设计特异性引物,对ORFV-HB株F1L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示:F1L基因PCR扩增产物大小为999 bp,编码333个氨基酸,系统进化树显示HB-YX株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,与福建FJ-GO株同源性高达98%,亲缘关系最近,属于同一分支。     

陆川猪MYL2基因生物信息学分析、真核表达载体构建及组织表达研究

【目的】了解陆川猪肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)基因CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,探究MYL2基因对肌肉生长发育的影响,为陆川猪的开发利用提供分子基础。【方法】采用RT-PCR技术扩增陆川猪MYL2基因CDS区,利用MegAlign软件对陆川猪MYL2基因与不同物种进行相似性比对和系统进化树构建,并通过生物信息学软件分析MYL2蛋白理化性质、疏水性和跨膜结构等;构建MYL2基因真核表达载体,利用脂质体法将重组质粒转染C2C12细胞并观察荧光;通过实时荧光定量PCR检测MYL2基因在陆川猪不同组织中的表达情况。【结果】陆川猪MYL2基因CDS区全长501 bp,编码166个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MYL2基因相似性为99.6%,存在2处突变：156 bp处C突变为T,为同义突变;404 bp处T突变为C,使异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。生物信息学分析显示,MYL2蛋白原子总数为2 633个,分子质量为18.879 ku,理论等电点(pI)为4.83,不存在跨膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。MYL2蛋白有16个位点可能会被磷酸化,在第...     

黄淮山羊Leptin cDNA的克隆及鉴定

根据GenBank中公布的山羊Leptin基因部分基因组核苷酸序列，设计合成一对引物，以山羊脂肪组织总RNA为模板，采用RT—PCR法，扩增出Leptin成熟蛋白编码cDNA序列，将此扩增产物克隆入pMD18-T载体，进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明，扩增的山羊Leptin基因编码序列长为441bp，编码146个氨基酸。同源性分析表明，山羊Leptin基因成熟蛋白编码cDNA与小鼠、人、猪、牛及绵羊基因相应序列的同源性分别为82．22％、87．76％、92．97％、96．15％和98．64％，氨基酸同源性为84．25％、86．99％、92．47％、97．95％和100．00％，说明Leptin是一组在进化上高度保守的蛋白质。山羊Leptin成熟蛋白cDNA的成功克隆，为进一步研究黄淮山羊Leptin基因全结构、基因表达与调控奠定了基础。     

湖北地区猪瘟病毒流行株E2基因的序列测定与分析

为分析猪瘟病毒湖北流行株(CSFV-HBWH-2017株)E2基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的CSFV-E2基因序列设计特异性引物,对CSFV-HBWH-2017株E2基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,E2基因PCR扩增产物大小为1 489 bp,编码496个氨基酸,系统进化树显示HBWH-2017株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为86.0%~96.0%,与湖南HNLY-2011株同源性高达96%亲缘关系最近,属于同一分支2.1c亚型,表明2.1c毒株已经成为湖北地区流行毒株。     

陆川猪DGAT2基因克隆、序列分析及表达水平研究

为了获得广西陆川猪二脂酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)基因编码区(CDS)序列,并探讨该基因在陆川猪和杜长大猪肌肉中的表达水平差异,试验以陆川猪背最长肌组织总RNA为模板,克隆获得DGAT2基因CDS序列并利用生物软件进行序列分析,同时采用实时荧光定量PCR技术检测150日龄陆川猪和杜长大猪背最长肌中DGAT2基因的相对表达量。结果表明:陆川猪DGAT2基因CDS序列长度为1 086 bp,与GenBank中的野猪、虎鲸、双峰骆驼、羊驼、佛罗里达海牛、野驴、马和家猫的同源性分别为99. 8%、93. 1%、93. 0%、92. 9%、92. 1%、91. 8%、91. 7%和91. 5%;陆川猪与野猪的遗传距离最近;陆川猪DGAT2蛋白由361个氨基酸组成,其中亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最少,DGAT2蛋白具有较弱的疏水性;在DGAT2蛋白高级结构中,α-螺旋占比39. 34%,无规则卷曲占比43. 21%,延伸链占比17. 45%; 150日龄陆川猪背最长肌中DGAT2基因相对表达量极显著高于同日龄的杜长大猪(P0. 01)。说明DGAT2基因在猪肌肉脂肪沉积过程中发挥了一定作用,但其作用于肌内脂肪的沉积机制尚不明确,可将DGAT2基因作为开展陆川猪肌内脂肪沉积分子机制研究的主要候选基因之一。     

广西巴马小型猪TXNIP基因真核表达载体的构建及鉴定

为了克隆广西巴马小型猪硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)序列并构建真核表达载体,为生产转TXNIP基因的广西巴马小型猪奠定基础,试验采用RT-PCR技术从广西巴马小型猪胰腺组织中扩增出TXNIP基因编码序列,连接至p MD18-T载体,测序鉴定后提取质粒,用SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切,回收的TXNIP片段连接至p EGFP-C1载体上,构建含TXNIP的真核表达载体p EGFP-C1-TXNIP;利用双酶切和测序对重组质粒p EGFP-C1-TXNIP进行鉴定,并将重组质粒转染β-TC6细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。结果表明:广西巴马小型猪TXNIP基因编码区序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,与Gen Bank已公布的猪TXNIP基因c DNA序列(序列号为DQ278874)对应区段同源性为99.7%;重组表达载体p EGFP-C1-TXNIP质粒转染β-TC6细胞能表现出绿色荧光。     

陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1基因克隆及序列分析

本研究旨在对陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1（acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1）基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中猪ACOX1基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术对陆川猪ACOX1基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明,陆川猪ACOX1基因CDS全长1 986 bp,编码661个氨基酸,陆川猪ACOX1基因与猪、牛、人、斑马鱼、鸡、猕猴、大鼠、小鼠、爪蟾序列同源性分别为99.5%、85.5%、87.1%、66.3%、75.6%、84.0%、82.3%、81.1%和69.1%。系统进化树分析结果表明,ACOX1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪ACOX1蛋白没有信号肽,没有形成跨膜结构。本研究成功克隆了陆川猪ACOX1基因,为阐明其在陆川猪脂肪沉积及代谢方面的调控研究奠定了理论基础。