桂花己糖激酶基因家族成员的序列及表达分析

  目的  研究桂花Osmanthus fragrans己糖激酶家族成员序列特征及表达变化规律。  方法  选取3个不同花色桂花品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’、‘玉玲珑’O. fragrans ‘Yulinglong’、‘金球桂’O. fragrans ‘Jinqiu Gui’,从转录组数据中筛选得到HXK同源基因,进行序列分析和系统进化树分析,并利用实时荧光定量PCR检测不同品种桂花不同组织及不同发育阶段的OfHXKs基因表达情况。  结果  筛选得到OfHXK1~OfHXK4基因,分析表明不同品种桂花OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因核苷酸序列相似性均高于99%。OfHXKs基因编码461~510个氨基酸残基,均包含2个保守的磷酸化作用位点和1个糖结合位点。OfHXK1和OfHXK2具有N端膜锚定结构,与拟南芥Arabidopsis thaliana AtHXK1与AtHXK2聚为一支;无跨膜区域的OfHXK3与AtHXK3亲缘关系较近,推测二者具有催化作用但无糖信号传导功能;OfHXK4蛋白腺苷结合位点处多出11个氨基酸残基,与AtHKL1和AtHKL2亲缘关系较近。4个桂花HXK基因成员在桂花1年生茎、2年生茎、嫩叶、成熟叶和花序中均有表达。随着花开放的进程,整体上OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,而OfHXK2基因在3个品种花序发育过程中表达模式不同。  结论  根据序列分析与进化树分析,推测桂花OfHXK1~OfHXK4均具有催化己糖磷酸化的功能,OfHXK1和OfHXK2具有糖信号感知和转导的功能。OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因随花序发育呈现有规律升降的表达模式,可能与其参与糖类物质代谢有关。图6表4参30     

大蒜己糖激酶基因AsHXK2的克隆及其参与根际促生菌缓解干旱胁迫的表达分析

为明确AsHXK2基因在根际促生菌缓解干旱胁迫下的作用,采用TA克隆方法克隆得到乐都紫皮大蒜AsHXK2基因序列,并对其基本特性进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了AsHXK2基因在大蒜不同组织和干旱胁迫、根际促生菌等条件下的表达情况。结果表明,AsHXK2开放阅读框全长1 500 bp,可编码499个氨基酸,分子量约为57.77 ku,理论等电点为6.37;亚细胞定位预测结果显示,AsHXK2蛋白主要定位于叶绿体,含有一个特异位点,属于己糖激酶2家族。在进化关系上,大蒜AsHXK2与天门冬科的芦笋HXK2亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,AsHXK2基因表达具有明显的组织特异性,其中鳞芽中的表达量最高。此外,不同组织中AsHXK2对根际促生菌作用下的干旱胁迫表现出不同的响应模式。干旱胁迫能够显著上调大蒜根、叶和鳞芽的AsHXK2表达水平;而在干旱胁迫施加根际促生菌的处理下,仅在叶中AsHXK2表达量显著高于干旱胁迫,表明叶片中AsHXK2对根际促生菌缓解干旱胁迫的响应较为明显。本研究为进一步探究根际促生菌缓解大蒜干旱胁迫的作用机制奠定了基础。     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

龙眼果实发育过程中果糖激酶活性及其基因表达分析

【目的】以石硖龙眼Dimocarpus longan cv.shixia为材料,研究了龙眼果实在发育过程中假种皮蔗糖、葡萄糖和果糖含量的变化规律,以及果糖激酶活性及其基因的表达变化情况.【方法】利用高效液相色谱测定果实糖含量变化;RT-q PCR测定基因表达变化量;构建原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中进行表达.【结果和结论】随着龙眼果实的发育,假种皮中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量逐渐增加,但进入成熟期后,糖含量水平趋于稳定;在果实成熟前,果糖激酶活性随着果实发育逐渐降低,由发育最初的25.97μmol·g~(-1)·h~(-1)下降到13.18μmol·g~(-1)·h~(-1),而在成熟时增大到22.44μmol·g~(-1)·h~(-1);荧光定量分析显示,龙眼果糖激酶基因的表达量在果实发育前期变化不大,而在假种皮迅速膨大、含糖量迅速上升时期则呈下降趋势;SDS-PAGE结果表明,成功构建了pET-32a-DlFRK原核表达载体,经IPTG诱导能够在大肠埃希菌中得到高效表达.     

家蚕丙酮酸脱氢酶激酶基因的克隆与原核表达

丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)在糖代谢的调控中具有重要的作用,为了研究家蚕PDK(BmPDK)的功能,以蚁蚕总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增了BmPDK的cDNA,构建原核表达载体pET-28a-BmPDK进行表达和纯化。结果显示,克隆的BmPDK全长cDNA与NCBI公布的序列一致;Western bloting检测表明BmPDK蛋白得到了表达,且主要以包涵体形式存在;IPTG最佳诱导浓度为0.8 mmol/L、最佳诱导时间为8 h;2,6-二氯吲哚酚法间接测定结果表明,纯化的BmPDK蛋白具有酶活性。     

菠菜硝酸还原酶基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR技术从低富集硝酸盐的菠菜品种中克隆得到硝酸还原酶(NR)基因,并进行了同源性分析;构建该基因的原核表达载体pET-NR,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,为深入研究并揭示菠菜的硝酸盐富集机制奠定了基础.结果表明:获得的NR基因包含完整的开放阅读框(2 781 bp),编码926个氨基酸,与菠菜、甜菜NR核苷酸序列的同源性分别为99％、80％,与其氨基酸序列的相同性分别为99％、86％.SDS-PAGE电泳显示重组菌经IPTG诱导表达出104 ku左右的蛋白质,与预期大小一致.     

欧洲鳗鲡免疫球蛋白轻链基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)Ig轻链基因cDNA全长序列,命名为AaIgL,其全长为1 016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡IgM血清发生特异性显色反应,证实了AaIgL基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:AaIgL在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏中也有较高的表达水平,而肝脏、肌肉、鳃以及肠中的表达量较低;欧洲鳗鲡经山羊IgG肌肉注射后脾脏和肾脏的AaIgL表达水平明显上升,其峰值分别为第7天和第14天,AaIgL在脾脏的表达量显著高于肾脏,但是第21天后均恢复至正常水平。以上结果表明,AaIgL在欧洲鳗鲡机体免疫防御中发挥重要作用,脾脏是AaIgL基因的主要表达器官。     

灰飞虱actin基因的克隆及原核表达

通过生物信息学分析获得了灰飞虱actin基因的序列信息,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆了actin基因的开放阅读框,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。序列分析结果表明,该基因开放阅读框长1 131 bp,编码377个氨基酸,蛋白质理论分子量为4.17×104,理论等电点为5.28。将此序列登录GenBank数据库,登录号为KC683802。序列比对发现,该基因序列在多个物种间保守,与褐飞虱actin基因的同源性高达95%。构建的原核表达载体pET32a-actin,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行获得表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达的蛋白质主要存在于包涵体中。     

板栗铁型超氧化物歧化酶基因(CmFeSOD)的克隆及原核表达

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是逆境条件下清除细胞内活性氧的关键酶,而铁型超氧化物歧化酶(FeSOD)作为该酶系中的关键酶之一,与植物的抗病性关系密切。根据板栗(Castanea mollissima Bl)转录组数据中分析得到FeSOD基因EST序列设计PCR扩增引物,以板栗幼叶的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得CmFeSOD基因cDNA序列,通过生物信息学方法分析该基因的cDNA序列,并推定其氨基酸序列,同时将该基因片段连接到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行不同条件的诱导表达。结果表明,板栗CmFeSOD基因开放阅读框(ORF)大小为705 bp,共编码234个氨基酸,推测其蛋白分子质量为26.016 5 ku,理论等电点(pI)为6.86,具有FeSOD家族的特征基序和保守结构域,GenBank登录号为KY312852。遗传进化分析表明,板栗CmFeSOD与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,通过原核表达获得CmFeSOD蛋白的分子质量约为29 ku,CmFeSOD蛋白在30℃,添加0.4 mmol/L IPTG,诱导6 h表达量最高,主要以包涵体的形式存在。     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因（ThGPX8）的克隆与原核表达

【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。     

杜仲Fls基因的克隆及原核表达

【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约44ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】获得了杜仲Fls基因的全长和ORF,并成功对其进行了原核表达。     

胞内分枝杆菌HBHA基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。     

解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

为挖掘新的拟除虫菊酯类农药降解基因,在大肠杆菌中实现异源高效表达,以本课题组前期筛选出的降解谱广泛、降解率较高的菌株解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)为研究对象,克隆其菊酯类农药降解酶基因BioH,在大肠杆菌中表达。通过解鸟氨酸拉乌尔菌全序列进行基因组注释、蛋白注释和通路注释,和已有菊酯类农药降解基因序列比对,筛选出潜在的具有菊酯类农药降解功能的基因;以解鸟氨酸拉乌尔菌基因组DNA为模板,根据功能基因序列设计特异性引物进行PCR扩增,回收目的片段后与pMD19-T载体连接,筛选阳性克隆并鉴定;酶切回收目的片段后和pET32a(+)表达载体连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,将验证正确的重组菌经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况。结果表明：通过筛选得到BioH基因,该基因具有水解酶的作用,同时也具有其他菊酯类农药降解基因序列中存在的保守五肽motif-GXSXG,PCR扩增后得到大小为783 bp的条带,通过重组技术获得阳性克隆,PCR扩增、酶切和DNA测序进行验证,重组菌经0.2 mmol/L IPTG诱导4 h后获得约为...     

枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的克隆与表达分析

为探究枸杞查耳酮异构酶CHI1基因在不同组织中的表达模式和功能,利用同源克隆的方法获得1个枸杞（Lycium chinense）LcCHI1基因（Genbank No. OR026273）,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对其组织表达的特异性进行分析,并进行原核表达分析。结果表明：1）枸杞查耳酮异构酶LcCHI1基因的cDNA序列全长695 bp,开放阅读框为633 bp,编码210个氨基酸,含有１个保守的Chalcone_3 family结构域。2）氨基酸序列比对显示,LcCHI1蛋白符合Chalcone蛋白结构特征且与其他物种Chalcone蛋白具有高度的相似性。聚类分析表明,LcCHI1蛋白与茄科的CHI蛋白单独聚成一支。3）LcCHI1在枸杞花、嫩叶与嫩枝中表达量较高,在根中表达量较低。随着枸杞果实的发育,LcCHI1表达呈先升高后降低趋势,在变色果中表达量最高。4）在原核表达载体中构建LcCHI1重组蛋白,经SDS-PAGE电泳分析在63 ku处出现表达蛋白。综上,LcCHI1基因在枸杞花和变色果中表达较高,并能进行原核蛋白表达,研究结果为枸杞类黄酮合成途径中CHI基因的功能验证奠定基础。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

龙眼鲜果贮藏品质采前优化调控技术比较

目的 探讨采收成熟度、树势与果期管理对龙眼果实采后贮藏性能和货架寿命的影响。方法 以‘石硖’龙眼Dimocarpus longan Lour. cv. Shixia为材料,以果实成熟度、树势、采前调控为试验因素,设计三因素三水平的单因素试验,采用SO₂保鲜纸处理采收的果实并于(5±1) ℃低温贮藏50 d,观察其出库和货架好果率(25 ℃左右),比较不同采前处理果实之间的贮藏性能差异。结果 80%~85%成熟度的适熟果出库好果率和货架好果率均高于完熟(95%~100%成熟度,CK)和过熟果,且过熟果最差。采前病害防治与营养调控果实的出库好果率和货架好果率均显著高于CK(无调控)(P<0.01),其中,采前病害防治效果最好,出库好果率为93.26%;其次是营养调控,出库好果率为84.23%,CK仅为67.71%。3种树势中,强壮树果实贮藏性最好,其次是衰弱树,CK(中庸树)最差。在所有处理中,采前病害防治果实贮藏效果最好,货架存放4 d好果率为84.86%;强壮树、营养调控和衰弱树果实货架4 d好果率分别为63.23%、56.14%和51.12%;过熟果最差,为26.91%。相关分析结果表明,采收时果肉可溶性固形物含量与果肉SO₂残留量、货架质损率均呈显著负相关,但与贮藏效果相关性不明显。结论 在龙眼果实生长期,做好采前病害防治和营养调控,合理挂果以保持树势,并于适当成熟度采收果实,可以获得较为理想的贮藏性能和采后寿命。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。