草本纤维生物提取菌株分泌的关键酶研究

为研究草本纤维生物提取菌株分泌的关键酶种类和特性,采用经典的DNS法对草本纤维生物提取菌株分泌的果胶酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶进行系统分析。结果表明,6 个草本纤维非纤维素降解菌株均能同步产果胶酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶;在培养的第9~11 h,菌株CBXW-3 分泌的果胶酶活力最高达123 IU/mL,其次为菌株CBXW-1 的果胶酶活力105 IU/mL;菌株CBXW-4 的甘露聚糖酶活力最高达214.2 IU/mL,其次为菌株CBXW-1 的甘露聚糖酶活力162.1 IU/mL;菌株CBXW-4 的木聚糖酶活力最高为111.4 IU/mL,其次为菌株CBXW-6 的木聚糖酶活力87.6 IU/mL。由此得出,6 个目标菌株分泌的草本纤维非纤维素降解酶系种类丰富,酶活力高,可为阐明草本纤维生物提取机理和开发微生物资源的应用价值提供科学依据。     

β-甘露聚糖酶高产菌株的紫外线诱变选育

为给生产实践提供具有更高产酶量的优良菌株,本研究以实验室保藏的一株地衣芽孢杆菌HDYM-04为原始出发株,经自然筛选、紫外线诱变,选育出一株β-甘露聚糖酶高产菌株U2-12。结果表明：依据致死率所选用的最佳诱变剂量为照射距离50 cm,照射时间为10 s,此时,菌株的总突变率为76.11%,正突变率为54.60%,负突变率为20.92%,地衣芽孢杆菌U2-12的产β-甘露聚糖酶能力是原始未紫外线诱变的出发株的242.19%,其遗传性状稳定。本研究可以为后续试验及生产实践提供优势产酶菌株,并为研究紫外线对β-甘露聚糖酶产酶基因的影响提供先决条件。     

细菌β-甘露聚糖酶研究进展

甘露聚糖酶是能水解任意β-1,4-糖苷键的内切水解酶,广泛存在于动植物和微生物中。为了研究细菌甘露聚糖酶相对于其他来源甘露聚糖酶的优点,本研究从细菌甘露聚糖酶的酶学性质、分子生物学研究及其饲料应用等方面进行综述。细菌甘露聚糖酶具有分子量小,发酵成本低,周期短,容易提取,最适反应pH值和温度的耐受区间都更宽泛等优势。因此,细菌甘露聚糖酶广泛应用于饲料,食品,石油开采,造纸等领域中。     

控制pH值和溶解氧对地衣芽孢杆菌HDYM-04分批发酵产β-甘露聚糖酶的影响

为了探究地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的能力,探究在发酵过程中pH值和溶氧水平对产β-甘露聚糖酶的影响。以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) HDYM-04为试验菌株,通过3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定酶活力。结果表明,控制pH值至7.0直至发酵结束,在发酵的初始阶段(12~20 h)效果明显,酶活力水平均处于3200 U/mL以上,同时菌体密度达到5.5以上。其次,控制溶氧在25%左右时,保持菌体的生长状态,酶活力高峰持续时间较长（6~20 h保持在3000 U/mL左右）。因此控制pH值7.0,溶氧在25%左右时,在发酵的初始阶段,有良好的产酶能力。     

枯草芽孢杆菌紫外诱变异甘露聚糖酶基因突变的研究

异甘露聚糖酶是制备益生元甘露寡糖的关键酶。对分泌异甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilisK-6)的紫外诱变正突变株K-6-9(Bacillus subtilis K-6-9)的诱变机理进行了研究。通过对出发菌株和正突变株的异甘露聚糖酶基因进行克隆和表达,以生物信息学的方法对异甘露聚糖酶基因序列和蛋白序列进行分析,得到突变株的突变碱基以及突变氨基酸。基因序列研究结果显示,突变体的总碱基突变频率为1.02,碱基突变类型包括碱基的颠换、转换。在检测到的11个碱基突变中,转换的频率(54.5%)是颠换频率(45.5%)的1.2倍,其中,C/T之间的转换所占比例最大,A-G和A-T也具有较高的替换频率,说明胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感。通过蛋白序列的比较分析,有2个氨基酸发生突变,由第21位保守氨基酸脯氨酸变异为非保守氨基酸丝氨酸,第23位非保守氨基酸丝氨酸变异为保守氨基酸谷氨酸。综合分析表明:保守区氨基酸与非保守区氨基酸的相互突变可能对其蛋白的正确组装及功能的发挥起重要作用。     

青花菜BoPGIP1基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证青花菜Bo PGIPl基因的功能,通过RT-PCR方法克隆得到青花菜Bo PGIP1基因完整的编码区序列,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达Bo PGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1),重组菌经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳检测,结果表明,在37 k Da处有一条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致;同时对重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1)的抗逆性进行分析,结果表明,BL21(p ET28a-Bo PGIP1)对Na Cl(0.4 mol/L)、Na HCO3(0.2 mol/L)和PEG6000(20%)的抗性明显高于对照菌株BL21(p ET28a),该抗性的证明为Bo PGIP1基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

维氏气单胞菌IscR异源表达调控大肠杆菌氧化应激耐受

以维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)基因组为模板,扩增iscR基因全长,经双酶切后与外源表达质粒pET28a连接,并利用电击转化法转化大肠杆菌BL21感受态细胞,通过阳性克隆子筛选,获得含有重组质粒pET28a-iscR的BL21重组菌株BL21-pET28a-iscR。以该重组菌株为研究对象,通过添加特定浓度的IPTG,诱导重组菌株中IscR蛋白表达,并采用0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L 5个H₂O₂终浓度对BL21-pET28a-iscR和转入空载质粒的对照菌株BL21-pET28a处理30 min,最后通过浓度梯度稀释点板试验,观察经不同H₂O₂浓度处理后细菌的菌落生长情况。研究结果显示,与对照菌株BL21-pET28a相比,在相同H₂O₂终浓度处理情况下,重组菌株BL21-pET28a-iscR的生长能力均较强,表明维氏气单胞菌来源的IscR蛋白可以异源表达并发挥功能,从而提高重组大肠杆菌的抗氧化应激能力。初步证明...     

干酪乳杆菌HDS-01甘露聚糖酶基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在借助基因克隆和生物信息学方法挖掘甘露聚糖酶基因的结构和功能。通过本地BLAST比对,从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) HDS-01的基因组信息中获得甘露聚糖酶基因M1。采用qRT-PCR测定MRS培养基和KGM培养基中M1的差异表达情况,表明KGM培养基中的魔芋粉更好的诱导M1的表达。以L.casei HDS-01基因组DNA为模板克隆基因M1,并利用生物信息学方法对其序列进行预测和分析。该序列长2640 bp,可翻译成879个氨基酸,包括一个2640 bp的开放阅读框;M1蛋白分子量为98723.55 Da,等电点为5.58。这种稳定的M1蛋白的二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲组成。研究结果不仅为甘露聚糖酶分子改造提供理论依据,同时有助于了解乳酸菌中甘露聚糖的代谢路径。     

苎麻脱胶果胶裂解酶基因的高效表达及序列分析

为使苎麻生物脱胶果胶裂解酶PelG403高效表达。将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至质粒拷贝数更高的pET28a载体中,导入Escherichia coli BL21(DE3)后进行诱导表达。采用DNS法进行酶活力测定,通过SDS-PAGE和Western Blot分析检验PelG403表达效果,并对其序列进行分析鉴定。结果表明:pET28a-G403/BL21的果胶裂解酶活力为335.8 U/mL,较pEASY-Blunt E1-G403/BL21提高了3.05倍;工程菌pET28a-G403/BL21表达产物分子量比预测带His标签的融合蛋白分子量(43.6 ku)略小;PelG403含387个氨基酸,N末端前35个氨基酸为信号肽;理论pI值为7.64,有4个半胱氨酸,不稳定系数为27.42;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构,属于Pec lyase C家族。因此,将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至pET28a载体中,并导入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,是苎麻脱胶果胶裂解酶基因pelG403高效表达的方法和途径,同时对其序列进行分析鉴定,为果胶裂解酶的纯化、关键位点分析、分子改造及其脱胶功能特性研究奠定基础。     

植物激素对水稻种子萌发过程中β-甘露聚糖酶活性的调控

为了研究GA3和ABA对种子萌发过程中产生的β-甘露聚糖酶活性的影响,以水稻种子作为研究材料,测定了GA3和ABA存在情况下的β-甘露聚糖酶活性,结果表明:GA3和ABA不仅对水稻种子萌发有明显的促进和抑制作用,对种子萌发过程中β-甘露聚糖酶活性也有显著的影响。50μMGA3可使β-甘露聚糖酶活性出现的时间从48h提早到吸水36h,并且显著提高酶的活性。100μMABA在强烈抑制种子正常萌发的同时也抑制了β-甘露聚糖酶活性。但是50μMGA3可恢复ABA对β-甘露聚糖酶活性的抑制作用。去胚的半粒水稻种子在水中吸涨时检测不到β-甘露聚糖酶的活性,但在水中加入50μMGA3后,可恢复去胚半粒种子产生酶活性的能力。因此,推测水稻种子萌发时β-甘露聚糖酶活性的产生可能是由胚中而来的某种物质所诱导,而这种物质很可能就是GA3。     

地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶分批发酵动力学模型的建立

为研究其菌体生长、产物合成以及底物消耗情况,本文以分离自亚麻温水沤麻液的β-甘露聚糖酶高产菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDYM-04为供试菌株。以初始魔芋粉加入量2 %、接种量6.7 %、初始pH值 8.0、培养温度37 ℃、搅拌速率300 r/min、通气量3 L/min、发酵周期30 h为基础发酵条件进行5L发酵罐发酵。并基于Logistic方程和Luedeking-Piret等方程建立了该菌株的菌体生长、产物生成、底物消耗三个分批发酵动力学模型,其相关系数分别为0.99021、0.98908、0.98812,均达到0.988以上,这些模型能真实描述菌体发酵过程中菌体生长、酶的合成以及底物消耗的情况。该试验为菌株HDYM-04的工业化应用奠定了理论基础并提供了实践指导,为小试数据的放大提供了重要参考。     

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01产甘露聚糖酶条件研究

旨在提高分离自东北酸菜发酵液中的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HDS-01产酶水平,为甘露聚糖酶的分离纯化和工业生产奠定基础,以MRS为初始培养基,设置不同培养基组分及发酵条件进行单因素试验,用DNS法和平板菌落计数法分别测定酶活和L. casei HDS-01生长量。试验实验结果表明L. casei HDS-01产甘露聚糖酶的最优条件如下:最适碳源及浓度为0.8%的果胶,最适氮源及浓度为0.2%的酵母提取物和硝酸铵,无机盐种类及浓度包括0.2%的柠檬酸铵、0.1%的磷酸氢二钾、0.9%的乙酸钠,最适装液量为100 mL/250 mL,最适接种量为7%,最适培养温度为37℃,初始pH 5.5。按照上述最适条件,在摇床转速为140 r/min条件下培养36 h后,酶活可达72.7±0.30 U/mL,较优化前的产酶水平提升了6.51倍。     

β-甘露聚糖酶对AA+鸡生产性能和免疫功能的影响

为了探讨日粮中添加β-甘露聚糖酶对AA+鸡生产性能和免疫功能的影响,选取1日龄健康的AA+肉鸡180羽,随机为2个处理组,每个处理3个重复,每个重复30只。试验分为对照组(基础日粮)和试验组（基础日粮+ 400g/Tβ-甘露聚糖酶）,试验期42天。结果表明β-甘露聚糖酶能不同程度的提高AA鸡各生长阶段的日增重和饲料转化率,但差异显著（P>0.05）,明显提高42d血液中免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的含量,差异显著。21d、42d的免疫器官指数、T淋巴细胞转化率和ND抗体水平也有不同程度的提高,与对照组相比,差异不显著（P>0.05）。说明β-甘露聚糖酶能提高肉用鹌鹑生长性能和增强免疫的功能。     

2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

一种新型果胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及序列分析

为了获得高酶活力的苎麻脱胶果胶裂解酶，为后续分子改造和新型苎麻生物脱胶酶制剂复配提供理论依据。将果胶裂解酶基因pel419从重组质粒pEASY-Blunt E1-pel419更换至pET28a载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达；用SDS-PAGE和Western Blot检验pel419基因的表达效果；用生物信息学软件分析Pel419理化表征和系统发育，预测其二级结构、高级结构及关键氨基酸位点。结果表明，工程菌pET28a-pel419/BL21的果胶裂解酶活力为434.4 U/mL,较pEASY-Blunt E1-pel419/BL21提高了1.7倍；Pel419含375个氨基酸，N末端前22个氨基酸为信号肽，理论pI值为6.59,有4个半胱氨酸，不稳定系数为18.20;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构，属于Pec lyase C家族；Pel419的Ca²⁺结合位点为ASP151、ASP153和ASP192,定位发现3个保守位点均暴露在三维空间的表面，并处于底物结合空间口袋。大幅度提高了Pel419表达量，并获得了Pel419关键结构信息。     

松毛虫肠道产蛋白酶菌株的筛选鉴定及培养条件研究

为了获得产蛋白酶能力高的细菌资源。采用酪蛋白平板法从松毛虫肠道中分离筛选得到16株产蛋白酶的菌株。通过比较透明圈大小和测定发酵后酶活力,筛选出一株产酶能力较高的菌株2N01。根据序列比对结果,构建关于2N01的系统发育树,将其鉴定为Enterobacter hormaechei。研究培养条件对该菌株生长的影响,确定2N01产酶培养的最适温度是40℃,最适pH 8.0,培养72 h左右出现产酶峰值,酶活力达50.07 U/mL。通过研究表明,菌株2N01是产蛋白酶的较好材料,具有一定的应用前景。     

莴苣种子萌发过程中细胞壁降解酶活性的动态变化

为阐明细胞壁降解酶活性与种子萌发之间的相互关系,以莴苣种子为材料,研究了内切-β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和β-甘露糖苷酶在莴苣种子萌发不同阶段的活性变化.结果表明,莴苣种子吸胀曲线呈"S"型,种子于18 h时开始萌发,随后萌发率迅速上升,48 h时达95.11％;干种子、吸胀种子、狭义萌发种子和完全萌发种子中细胞壁...     

巴西橡胶树K+通道蛋白HbKCO1的原核表达

K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用。利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提。本研究在成功克隆巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKCO1 cDNA 编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS和BL21(DE3)菌株。经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3) pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达。HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶信号肽的序列分析及其在大肠杆菌中的分泌特性

为使地衣芽孢杆菌信号肽序列实现异源基因在大肠杆菌中的分泌表达,将地衣芽孢杆菌中编码耐高温α-淀粉酶的基因克隆在大肠杆菌表达载体pET-22b的T7启动子下游,转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌株经乳糖诱导后,在上清液中能够检测到淀粉酶活性。表明该芽孢杆菌淀粉酶基因5′端信号肽序列能够将大肠杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。同时,用该信号肽序列还实现了甜蛋白monellin基因在大肠杆菌中的分泌表达。     

产类黄酮链霉菌的紫外线诱变选育

诱变选育高产类黄酮链霉菌菌株,采用不同强度的紫外线对出发菌株链霉菌HNS2-2单孢子悬液诱变处理。以出发菌株作为对照,分光光度法测定诱变菌株发酵产物黄酮类物质含量为评价指标,进行反复筛选。在20 W紫外灯、辐射距离30 cm、照射20 s条件下,获得高产菌株251,其黄酮类物质产量达41.87μg/mL,比出发菌株提高15.52%,且连续7次传代稳定性能稳定。通过紫外诱变选育的方法,能提高出发菌株黄酮类物质产量。