芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明：MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。     

芒果SEPALLATA3基因的生物信息学与表达分析

SEPALLATA3（SEP3）属于MADS-box基因家族,与植物的成花时间和花器官分化有关。在本研究中,从芒果转录组数据中挖掘获得了2个MiSEP3s基因,分别命名为MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息学分析显示,MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因组DNA长度分别为4189 bp和3721 bp,2个基因的开放阅读框长度一致均为732 bp,编码244个氨基酸,蛋白质分子量分别为59.29 kD和59.28 kD。2个MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS结构域和K-box结构域。启动子序列分析显示,2个MiSEP3s基因启动子均包含光响应元件、激素响应元件、逆境响应元件和转录因子结合位点,但调控元件种类和数量存在差异。基因表达模式分析显示,2个MiSEP3s基因在营养期的茎、叶和芽中表达量较低,但在成花转变后期的芽中持续上调表达,在花中达到表达高峰。该结果为MiSEP3基因功能的研究提供参考。     

芒果MiCOL6基因的克隆及其生物信息学和表达分析

CONSTANS（CO）是光周期途径的核心调控因子,其可以整合光质和生物钟输出的信号调控植物成花。在前期转录组研究的基础上,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到芒果的1个CO基因的cDNA全长,序列长度为678 bp,根据与拟南芥CO家族基因的相似性,将其命名为MiCOL6。生物信息学分析显示,该基因编码226个氨基酸,分子量为26.88 kDa,等电点为4.85,属于亲水性的非分泌蛋白。保守结构域和进化树分析显示,该基因仅含1个CCT结构域,属于CO基因家族的第4组;二级结构分析表明,该蛋白主要以无规卷曲和α-螺旋为主;亚细胞定位预测显示该蛋白定位在细胞质膜上的概率最大;不同花发育时期表达模式分析表明,MiCOL6基因在杧果的花芽分化期表达量最高。本研究结果为进一步研究芒果MiCOL6基因在芒果中的功能提供理论基础。     

芒果AP2/ERF转录因子MiERF2基因的克隆及表达分析

芒果(Mangifera indica L.)是热带地区主要的经济作物之一,也是典型的呼吸跃变型水果,其成熟衰老与乙烯有关。AP2/ERF转录因子在植物中广泛存在,研究发现这类转录因子参与果实内源乙烯合成的信号转导,是乙烯信号通路中的关键基因,在植物生长发育、逆境胁迫响应及贮藏运输过程中发挥重要作用。为了探究AP2/ERF转录因子对采后芒果成熟衰老的影响,本研究以贵妃芒果品种为研究对象,通过PCR技术克隆得到了1个长度为915 bp,编码305个氨基酸的MiERF2基因。通过生物信息学分析得知：MiERF2蛋白分子式为C₁₄₄₉H₂₂₅₉N₄₃₃O₄₇₀S₁₁,分子量为33 618.16 Da,总原子数为4622,理论等电点为7.66,带30个正电残基,带29个负电残基,蛋白具有亲水性,结构不稳定;MiERF2蛋白不含信号肽和跨膜区域,磷酸化修饰以苏氨酸为主,包含1个AP2保守结构域;二级结构以66.12%的无规则卷曲为主,还含有24.67%的α-螺旋、1.32%的β-折叠、7...     

芒果MiFY基因克隆和表达模式分析

FY是拟南芥自主途径中调控成花的基因,FY通过与RNA结合蛋白FLOWERING CONTROL LOCUS A (FCA)相互作用下调成花抑制基因FLOWERING LOUS C (FLC)的表达从而促进开花。目前关于FY基因如何调控芒果成花的机制尚无研究报道。通过挖掘芒果转录组数据克隆获得1个FY基因,命名为MiFY。生物信息学分析显示,MiFY基因的ORF全长为2178 bp,编码725个氨基酸,蛋白质分子量为799.59 kDa,理论等电点为8.72,氨基酸序列中含有WD40和Cytadhesin_P30两个保守结构域。基因表达模式分析显示,MiFY基因在2个芒果品种的开花期均具有较高的表达水平,而在营养生长期表达水平较低。因此推测MiFY基因可能在调节芒果成花中起着重要作用。     

巴西橡胶树SnRK1家族基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶I(Sn RK1)是植物糖信号途径的关键因子,广泛参与植物生长发育。以蓖麻Sn RK1基因序列为探针,采用同源克隆的方法获得了橡胶树Sn RK1家族2个基因的全长c DNA,分别命名为Hb Sn RK1-1(KX237690.1)和Hb Sn RK1-2(KX237691.1)。2个Hb Sn RK1基因均编码含515个氨基酸且序列高度一致(96.5%)的蛋白质;2个基因均含10个外显子、9个内含子,且外显子大小相近,但基因长度差异明显。在6种橡胶树组织中,2个Hb Sn RK1基因均有表达,但Hb Sn RK1-1在胶乳(产胶细胞乳管的细胞质)中的表达量明显高于Hb Sn RK1-2;在叶片发育不同时期,Hb Sn RK1-1的表达变化不显著,而Hb Sn RK1-2的表达随叶片发育明显下降;在胶乳中,Hb Sn RK1-1的表达显著受乙烯和茉莉酸诱导、受2,4-D抑制,但Hb Sn RK1-2表达受激素处理的影响较小,推测Hb Sn RK1可能参与胶乳再生的激素调控。     

香蕉MaTET基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆香蕉果实采后成熟相关基因MaTET的全长cDNA,利用生物信息学方法分析MaTET基因及推导蛋白的序列,再利用RT-PCR技术对该基因的组织器官表达特性和在果实采后成熟过程中的表达特性进行分析。结果表明,MaTET的cDNA序列全长为1 234 bp,包含一个852 bp的完整开放阅读框,编码283个氨基酸残基,5′端非编码区222 bp,3′端非编码区160 bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG。MaTET蛋白具4个跨膜区域,属于四跨膜蛋白（Tetraspanins）,拥有多个与信号传导有关的修饰位点,在系统发生上更接近鹰嘴豆、野草莓和番茄等双子叶植物。MaTET可在香蕉根、茎、叶、花以及果实中表达,在根和叶中的表达量高于其它器官;MaTET在自然成熟香蕉果实中的微黄(TY)阶段开始上调表达,在黄多于绿(MY)阶段表达量急遽升高,随后降低,乙烯可增强MaTET表达且表达高峰提前至绿多于黄(MG)阶段,1-MCP抑制MaTET的表达。     

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术,以烟草AAG59585序列为探针,获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因的全长cDNA,命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证,该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明:ScTD基因全长2 120 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,164~1 681 bp),编码505个氨基酸,该基因编码蛋白定位于微体,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达,其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明:该基因在甘蔗各组织中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的43.16倍,其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯,分别为6.90倍和4.40倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

以甘蔗(Saccharum spp.hybrid)抗黑穗病基因型崖城05-179为材料,采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列(GenBank登录号为KF279661),命名为ScChiⅦ1,序列长907 bp,编码299个氨基酸,属于糖苷水解酶第19家族,预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示,该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列(GenBank登录号为KF279662)分析显示,该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明,甘蔗黑穗病菌胁迫下,ScChiⅦ1在抗病(崖城05-179)和感病基因型(柳城03-182)中差异表达,推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示,ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达,但在芽中表达量最高,推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。     

胡椒PnNPR1基因的克隆与表达分析

根据胡椒病程相关基因非表达子1(Nonexpressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR方法获得其家族成员的1个全长c DNA,命名为Pn NPR1,长度1 712 bp,开放阅读框1 362 bp,编码454个氨基酸。预测Pn NPR1分子量为141.56 ku,理论等电点为4.98。该基因含有BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域,具有植物NPR1所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn NPR1与苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR结果表明,Pn NPR1在胡椒叶片、根、茎和花中均表达,在叶中的表达量最高。辣椒疫霉菌诱导后,Pn NPR1基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn NPR1的功能研究提供了理论依据。     

芒果乙烯响应转录因子MiERF113基因的克隆及表达分析

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的热带水果,深受消费者的喜爱。我国是世界第二大芒果生产国,其中广西为全国最大的芒果产区。芒果是典型的呼吸跃变型水果,其果实在采摘后因乙烯大量释放容易软化腐烂,导致货架期短,影响产业的发展。乙烯响应转录因子（ethylene response factor, ERF）是乙烯信号通路中的关键基因,参与果实内源乙烯合成的信号转导。为了探究ERF在芒果果实采后成熟调控的作用机制,以‘台农1号’芒果为研究对象,依据前期完成的芒果转录组数据结果,筛选并克隆得到1个ERF基因（MiERF113）,利用生物信息学方法分析MiERF113的基本理化特征、保守结构域、蛋白质结构、进化关系等;利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时期的特异性表达进行分析。结果表明：MiERF113基因的开放阅读框（ORF）长度为681 bp,编码227个氨基酸,预测蛋白质分子量为25.61 kDa,理论等电点（pI）为6.07,总平均亲水性为-0.883,有32个磷酸化位点,无跨膜螺旋结构,无信号肽。蛋白质结构域预测MiERF113蛋白仅含有1个保守的AP2结构域,且该结构域中第14和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸,符合ERF亚家族的典型结构特征。将芒果与拟南芥、猕猴桃、阿月浑子、苹果、柑橘和茶树的ERF氨基酸序列进行进化分析,发现MiERF113与阿月浑子ERF113的同源性较高,亲缘关系最近。利用qPCR检测MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时间果皮和果肉部位的表达情况,结果显示,MiERF113基因在果皮和果肉中均有表达,且随着果实不断成熟其表达量在逐渐增加,在采后贮藏12 d时表达量达到最高。本研究为揭示MiERF113基因在芒果采后成熟过程中的调控作用提供理论依据。     

茶树CssHSP18.1基因克隆及表达分析

sHSPs基因家族可编码一类小分子的热激蛋白,广泛分布于植物中,具有分子伴侣的功能,在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用。通过基因克隆的方法,获得1个茶树CssHSP18.1基因的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,其全长480 bp,编码159个氨基酸。生物信息学分析表明,CssHSP18.1蛋白含有1个典型HSP20结构域,相对分子质量约为18.25 kDa,等电点为5.68,偏酸性,与栎和苹果亲缘关系最近,无信号肽与跨膜结构。RT-qPCR分析表明,CssHSP18.1在甘露醇（D-Mannitol）处理下表达量低于对照组;γ-氨基丁酸（GABA）能促进该基因的表达,在处理后1 h时表达量达到峰值;吲哚乙酸（IAA）和聚乙二醇（PEG 6000）处理后,CssHSP18.1在0.5 h时表达量最高,即GABA、IAA、PEG 6000均可诱导CssHSP18.1的表达。为获得CssHSP18.1可溶性蛋白,构建了pET-28a-CssHSP18.1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及IPTG（异丙基- -D-硫代吡喃半乳糖苷）诱导浓度进行优化。结果显示,CssHSP18.1蛋白最佳表达菌株为BL21（DE3）,最佳诱导温度和IPTG浓度分别为30℃和1.2 mmol·L^-1。最后,采用Western blot对表达的CssHSP18.1蛋白进行验证。本研究为进一步揭示CssHSP18.1基因的生物学功能提供依据。     

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。     

稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析

稻曲病由稻曲病菌引起,是水稻穗部的重要病害。利用同源克隆和RACE技术,根据丝状真菌相对保守的氨基酸序列设计简并引物,从稻曲病菌中分离了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)编码基因的全长cDNA序列,命名为UvHog1。UvHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与稻瘟病菌MgOsm1(AAF09475.1)、球孢白僵菌BbHog1(AAS77871.1)、烟曲霉AfOsm1(XP752664.1)和隐球酵母CrHog1(AAM26267.1)等MAPK高度同源,相似性分别为95%、93%、88%和81%。系统聚类结果表明,UvHog1与酵母Hog1MAPK同源。在盐胁迫条件下,UvHog1的相对表达量明显降低,表明UvHog1参与了对盐胁迫的信号响应。     

花生油质蛋白基因的克隆与表达分析

油质蛋白作为贮藏蛋白的一种,特异性表达在油料种子中。本研究从花生中克隆得到3个Oleosin22基因,分别命名为AhOleosin22a,AhOleosin22b,AhOleosin22c。AhOleosin22a基因全长为630bp,编码210个氨基酸;AhOleosin22b基因全长为636bp,编码212个氨基酸;AhOleosin22c基因全长为582bp,编码194个氨基酸,均属于Oleosin蛋白质家族。通过荧光定量PCR对Oleosin22基因在花生中的表达模式进行分析。结果显示,AhOleosin22基因在种子中的表达量最高。本研究为阐明Oleosin22基因在花生油脂合成的生理生化机制中的功能奠定了理论基础,丰富了花生品质改良育种的基因资源。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。