橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。     

甘蔗镰孢菌碳水化合物结合模块效应基因Fs11724的分离鉴定及功能分析

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起毁灭性病害甘蔗梢腐病(sugarcane pokkah boeng disease,PBD)的主要病原菌之一.病原菌分泌的效应蛋白在病原与植物互作中发挥至关重要的作用.本研究基于课题组前期甘蔗镰孢菌全基因测序数据,设计基因特异性引物,通过RT-PCR扩增得到一个新的...     

植物萃取液对病原细菌、真菌的抑制作用

使用平板测定方法,试验443种植物萃取液对4种植物病原细菌(稻白叶枯菌、柑橘溃疡菌、烟青枯菌和白菜软腐菌)和6种植物病原真菌(稻纹枯菌、棉花枯萎菌、黄瓜枯萎菌、烟炭疽菌、小麦赤霉菌和稻瘟菌)的抑制作用.有60种植物萃取液对供试的4种细菌中的1种有抑制作用,46种植物萃取液对供试的3种植物病原真菌(稻纹枯菌、烟炭疽菌与稻瘟菌)中的1种有抑制作用.     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

云南省玉米茎基腐病病原镰孢菌的种群结构研究

从9个不同州市采取玉米茎基腐病病害样本分离纯化并鉴定其病原,分析云南省玉米茎基腐病的主要病原镰孢菌及分布情况,依据形态特征和rDNA-ITS序列分析,云南省玉米茎基腐病的病原包括Fusarium graminearum(40.74%)、F.verticillioides(37.96%)、F.fujikuroi(3.70%)、F.incarnatum(3.70%)、F.oxysporum(1.85%)、F.proliferatum(1.85%)、F.commune(5.55%)、F.chlamydosporum(2.78%)和F.redolens(1.85%)。F.graminearum和F.verticillioides为优势种,F.graminearum主要分布于昆明及其以东的地区,F.verticillioides主要分布于昆明市及其以西的地区,二者在云南的大部分地区均有分布;其余菌株出现频率均低于5.55%,仅分布在1~3个地区。     

苎麻炭疽病病原菌的分离与鉴定

苎麻是中国特有的韧皮纤维作物,炭疽病是苎麻重要病害之一,影响苎麻纤维产量和品质。试验采用植物病原真菌传统分离法,对采自湖北省、湖南省和江西省苎麻主产区感染炭疽病的苎麻叶片进行炭疽病病原菌的分离,并通过对病原菌形态特征观察、致病性测定、核糖体内部转录间隔区序列(internal transcribed spacers, ITS)和β-微管蛋白序列(β-tubulin, TUB2)的克隆和分析,对引起苎麻炭疽病的病原进行鉴定。经形态学和分子生物学结合分析,确定引起我国苎麻炭疽病的病原主要有胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、果生炭疽菌(C.fructicola)、暹罗炭疽菌(C.siamense)和希金斯炭疽菌(C.higginsianum)。根据新的炭疽菌种的分类方法,苎麻炭疽病病原分属于胶孢炭疽菌复合群(C.gloeosporioides complex)和毁灭炭疽菌(C.destructivum complex)复合群。研究结果为研究苎麻炭疽病菌的生物学特性、流行规律以及苎麻抗炭疽病分子育种研究和有效绿色防治策略提供理论依据。     

麻疯树毒蛋白(curcin)的抗真菌活性研究

以植物病原真菌水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、松赤枯病菌(Pestalotia funerea)、玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani Kuha)、油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib)de Bary]为实验菌,检测了麻疯树毒蛋白(curcin)的抗真菌活性.结果表明,5μg/mL curcin能明显抑制菌丝生长和孢子的产生.浓度提高到50 μg/mL时,水稻稻瘟病菌基本不形成孢子,对松赤枯病菌的孢子形成抑制率达83.8%.光镜下可见处理菌丝明显缩小、变形.SDS-PAGE显示,处理菌丝的蛋白质条带减少.curcin对菌丝生长和孢子发育的阻碍作用可能与curcin阻碍了蛋白质合成有关.     

不同SDS-PAGE分离胶浓度条件下大豆贮藏蛋白亚基的分辨效果

采用SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度分别为9%、10%、11%、12%、13%的凝胶系统,探讨不同分离胶浓度条件下大豆籽粒主要贮藏蛋白(7S和11S组分)亚基的分辨效果.结果表明,分离胶浓度大小对大豆贮藏蛋白(7S和11S组分)亚基电泳图谱分辨率的影响非常明显.分离胶浓度为9%和10%时,7S组分亚基(α'、α和β)分辨效果较好;分离胶浓度为13%时,11S组分各亚基(A3、A4A2、A1aA1b、A5、B3、B1aB1bB2和B4)分辨效果较好.如需获得较好的7S和11组分亚基综合分辨效果,以分离胶浓度为12%的凝胶系统为佳.     

中国大豆锈病研究

1899年在中国吉林首次报道了由豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi Syd)引起的大豆锈病.20世纪60年代大豆锈病成为热带、亚热带地区大豆生产中最严重的病害.中国于20世纪70年代开始了较为系统的研究,本篇综述介绍了中国在大豆锈病的病原菌分布及其寄主、产量损失,病害流行、病原生活周期、病原与寄主的互作、抗锈资源鉴定、抗锈遗传、抗锈育种和综合防治等方面的研究进展.     

解淀粉芽孢杆菌HAB-7对18株植物病原真菌的抑制作用

HAB-7是一株分离自豇豆根际土壤、具有较强抑菌作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。研究HAB-7对18株植物病原真菌及其发酵液粗提蛋白对植物病原的抑制作用，并测定其对番茄种子的促生作用。采用平板对峙法测定其对18株植物病原真菌的抑制活性，以橡胶树炭疽菌为指示菌，对其发酵上清液经60%、80%硫酸铵盐析获得的抗菌粗蛋白进行测试；并将HAB-7菌液稀释成6个浓度梯度，分别用来对番茄种子进行促生测试。结果显示：HAB-7对18株植物病原真菌的平均抑菌率为61.03%；     

暹罗炭疽菌转录因子CsAtf1互作蛋白的筛选和鉴定

碱性亮氨酸拉链bZIP是真核生物转录因子家族之一,通过调控基因的表达来参与调控生长发育及生物、非生物胁迫应答等生理过程.已有报道表明bZIP转录因子Atf1与多种病原真菌的生长发育及致病力相关.由于转录因子通常能够在其他互作蛋白的参与下与顺式作用元件特异性结合,从而调节靶基因表达,因此筛选其互作蛋白对深入了解转录因子的...     

暹罗炭疽菌中脂滴包被蛋白Cap20与乙酸激酶CsAck的互作研究

暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是一种重要的病原真菌,是我国橡胶树炭疽病（Colletotrichum leaf disease, CLD）的田间优势病原种,也是热带、亚热带地区许多其他农林作物炭疽病的主要病原种。脂滴是细胞的中性脂,存在于绝大多数真核细胞中,是细胞内甘油三酯的主要贮存形式。脂滴在细胞内可以参与脂质代谢、膜转运、蛋白降解和信号传导等。包被蛋白（perilipin）是脂滴表面最丰富的脂质相关蛋白,主要存在于动植物体内,对细胞内脂滴代谢起着重要的调控作用。Cap20是暹罗炭疽菌中包被蛋白的同源蛋白,前期证实Cap20是一个致病相关蛋白,它参与了炭疽菌附着胞膨压形成、脂滴数量和致病性。了解其互作蛋白和互作的生物学意义可能为深入了解脂滴包被蛋白参与的致病分子机制具有重要意义。课题组前期通过酵母双杂交技术在暹罗炭疽菌cDNA文库中筛选到一个与Cap20互作的候选蛋白乙酸激酶,本研究克隆了该乙酸激酶的编码基因,并进行了蛋白结构和同源蛋白聚类分析。结果表明,乙酸激酶编码基因的DNA大小为1312 bp,包括一个内含子,cDNA为1248 bp,编码415个氨基酸,含有一个乙酸激酶结构域,命名为CsAck。然后构建含6×his标签的原核表达载体PET32a-CsAck,利用其和含GST标签的pGEX6p-1-Cap20（先前构建）进行蛋白表达和纯化,获得含有6×His标签的融合蛋白CsAck和含有GST标签的Cap20。通过Pull down验证了Cap20和CsAck蛋白之间的体外互作。最后,构建含有潮霉素转移酶基因HPH的表达载体PXY203-CsAck-S和含有氯嘧磺隆抗性基因ILV1的表达载体pCB1532-GFP-Cap20,将它们共同转化暹罗炭疽菌野生型菌株获得转化子。Co-IP（Co-immunoprecipitation）的结果证实Cap20和CsAck在暹罗炭疽菌中可以相互作用。该结果证实了致病性相关蛋白Cap20和乙酸激酶CsAck在体外和体内均可发生蛋白互作,可为进一步研究Cap20在暹罗炭疽菌中的致病功能和调控机制奠定基础。     

向日葵柄锈菌效应蛋白的预测及筛选

向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引发向日葵锈病,对生产具有破坏性。为深入了解锈菌效应蛋白,研究病原与寄主的互作机理,在获得向日葵柄锈菌分泌蛋白组的基础上,利用生物信息学软件预测及分析向日葵柄锈菌效应蛋白,采用qRT-PCR检测其中7个候选效应蛋白基因在接种叶片中的相对表达量。结果表明：在供试的900个锈菌的分泌蛋白中预测到候选效应蛋白497个。基因特征分析显示,开放阅读框长度在200～399 bp之间的最多;信号肽长度集中在16～27个氨基酸残基（占92.96%）;信号肽氨基酸组成中亮氨酸出现频率最高,其次为丙氨酸、异亮氨酸;信号肽识别位点以SpⅠ型为主。本研究获得了7个向日葵柄锈菌的效应蛋白,qRT-PCR检测表明柄锈菌接种向日葵叶片后,与纯孢子相比,这7个效应蛋白编码基因均上调表达,说明其参与了锈菌侵染向日葵的过程。     

一个木薯候选STK类抗病基因的分离及其生物信息学分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(STK)结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物,以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板,通过PCR扩增,均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列,比对发现,木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测,获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因,命名SSK1。序列分析表明,该基因编码621 aa,有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域,具有典型的STK类抗病基因的保守结构,是一个候选的抗病基因,可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。     

海南省3种油茶炭疽病菌的致病力及其生物学特性研究

为了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差异及生物学特性,采用刺伤接种法对3种油茶炭疽病菌(C.fructicola、C.siamense、C.camelliae)的致病力进行测定,发现不同病原间致病力存在显著差异,其中C.fructicola致病力最强,C.siamense致病力次之,C.camelliae致病力最弱。对3种炭疽病菌生物学特性研究发现,3种病菌最适生长温度、p H值及光照条件类似,同时均可利用多种碳、氮源,但不同病菌生长的最优碳源、氮源有一定差异。C.fructicola的产孢量、分生孢子萌发率及附着胞形成率均高于C.siamense及C.camelliae。不同油茶炭疽病菌生物学特性的差异可能与其致病力分化有关。本研究结果将为进一步研究不同油茶炭疽病菌致病差异机制提供理论依据。     

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。     

小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1 1A转录活性检测及互作蛋白筛选

为了进一步解析小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A的调控机制，本研究对其进行了自激活性检测。利用已构建好的小麦酵母cDNA文库，以TaNRT1.1-1A为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白，回转试验进一步验证其互作关系。结果表明，TaNRT1.1-1A无自激活活性，酵母双杂技术筛选小麦cDNA文库，共获得2个候选互作蛋白，候选蛋白Sdr I-like主要参与植物病害有关的应答响应。Sdr I-like的回转验证结果表明，该蛋白可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。该结果可为进一步研究TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。     

TaJAZ7D蛋白在冬小麦JA抗寒途径中的作用

转录抑制因子JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白是茉莉酸（Jasmonate,JA）信号转导途径的核心元件,前人研究发现,拟南芥中AtJAZ1、AtJAZ4与AtICE1蛋白互作可抑制 AtICE1基因的转录,负调控拟南芥的抗寒性,然而小麦中TaJAZ与TaICE蛋白的互作调控机制尚不清楚。本研究以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号（Dn1）为试验材料,以与拟南芥AtJAZ1、AtJAZ4蛋白高度同源的TaJAZ7、TaJAZ12蛋白为对象,检测外源茉莉酸甲酯（MeJA）对低温胁迫下 TaJAZ7、 TaJAZ12基因表达量的影响。结果发现, TaJAZ7基因的表达量与温度变化呈明显负相关,故对TaJAZ7(以TaJAZ7D为研究对象进行后续研究)蛋白进行生物信息学分析和亚细胞定位,并利用酵母双杂交技术验证TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白的互作。生物信息学分析表明, TaJAZ7D基因编码区序列全长为633 bp,为不稳定的亲水性混合型蛋白;TaJAZ7D蛋白有典型的TIFY和Jas结构域,属于TIFY家族。亚细胞定位发现,TaJAZ7D蛋白位于细胞核中。酵母双杂交验证试验发现,TaJAZ7D蛋白与TaMYC2和TaICE41蛋白分别存在互作关系。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。