刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因,同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子,并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体,验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体,并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达,经鉴定,转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织,经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织,经PCR鉴定,茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在,初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立,验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性,为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

小麦愈伤组织再生相关基因TaTCP-1A的克隆及功能鉴定

为深入探讨小麦再生分子机制、给建立高效的小麦遗传转化受体系统奠定基础,通过电子拼接、RT-PCR及RACE等方法在小麦品种郑麦7698中分离到一个与小麦愈伤组织再生相关的候选基因TaTCP-1A。序列分析表明,该基因的cDNA序列全长为2 163bp,其中包含了一个1 623bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。qRT-PCR结果表明,该基因具有组织表达特异性,在愈伤组织中表达量最高;在愈伤组织形成阶段,随诱导时间的延长,其表达量逐渐上升,当诱导11d时表达量达到峰值,随后呈下降趋势;此外,TaTCP-1A基因在胚性愈伤组织中的表达量高于非胚性愈伤组织。基因沉默结果表明,转TaTCP-1A RNAi小麦植株的再生率比对照降低了85.09%,这一结果初步证明该基因对小麦愈伤组织再生有一定的促进作用。     

茶树两个MYB转录因子基因的克隆及功能验证

第4亚组R2R3-MYB可能参与木质素合成的调控,从而影响植物的生长发育。本文利用RACE技术,克隆了两个茶树第4亚组MYB转录因子（CsMYB4-5和CsMYB4-6）。生物信息学分析发现CsMYB4-5氨基酸序列与金鱼草中的AmMYB330一致性为48.45%,与拟南芥中的AtMYB3一致性为44.79%;CsMYB4-6氨基酸序列与金鱼草中的AmMYB308一致性为69.80%,与拟南芥中的AtMYB4一致性为62.41%。实时荧光定量PCR分析表明两个基因均在根中高表达而在茎中低表达。原核表达分析表明,CsMYB4-5和CsMYB4-6的分子量分别为32 kD和27 kD左右。烟草转化实验表明,与野生型烟草相比较,转CsMYB4-6基因的烟草叶片的叶脉紧缩而脉间凹凸不平,老叶有白色斑点,而转CsMYB4-5基因的烟草老叶发黄。     

甜瓜自毒作用相关MYB转录因子的克隆和表达分析

根据甜瓜自毒作用相关MYB转录因子核心区序列设计引物,采用RACE技术获得MYB c DNA全长。生物信息学分析表明,该转录因子全长1 164 bp,包括174 bp的5′非翻译区,105 bp的3′非翻译区,885 bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,属于MYB类转录因子中R2R3-MYB类型,与黄瓜R2R3-MYB类转录因子的氨基酸序列的同源性达97.28%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在植株浸提液胁迫处理2 d时表达量最高,推测该转录因子可能参与了甜瓜自毒相关基因初期的诱导表达,使植株对自毒胁迫做出主动的系统性应答反应。     

诸因素对转基因棉花愈伤组织的影响

将携带外源基因的农杆菌菌液稀释20%(OD600=0.03)和棉花3～5d无菌苗下胚轴中部横切段共浸5min后,置于22～25 C共培养2d,其愈伤组织生长正常,出愈率也较高,是棉花对农杆菌较为理想的感受态.     

龙眼胚性愈伤组织NBS-LRR类抗性基因的同源克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织cDNA为材料进行龙眼抗性基因同源克隆(RGA).结果表明:在51个阳性克隆中有29条没有重复的序列与已知抗性基因具有同源性.经多重序列对比发现,29条序列均发现典型的NBS结构,其中26条序列具有完整的NBS结构域基序,包括p-Loop/Kinase-1a[GGV (I/M) GKTT],kinase-2[LVDDVW(D)],kinase3a (GSRⅢTTRD)以及一个疏水的[GL(F)PL(F)AL];3条序列表现为截断的NBS序列,其中有2条出现终止信号.进化树分析发现,29条序列可分为明显的2个类群,仅2条序列归为TNL类群,其余27条均为non-TNL类群.non-TNL类群可以进一步分为4个亚类群,non-TNL-1、non-TNL-2类群与毛果杨BED-NBS-LRR (BNL)基因有较高同源性,non-TNL-1类群kinase-2[LLMDGLW]基序在组内保守,但与已知R基因存在较大差异.通过RACE克隆non-TNL-1成员NBS39全长发现,NBS39氨基酸残基序列N-端具有明显的coiled-coil结构,pfam分析具有NBS及LRR8功能域,但不具有BED-finger结构.     

生长调节剂和基因型对诱导玉米花药愈伤组织和胚状体的作用

作为一种交替的和补充的选育玉米自交系的方法,花药培养产生单倍体世代已引起许多研究者的兴趣,并已取得很大进展(Kuo 等,1986)。愈伤组织诱导率对育种程序中的单倍体世代法的实际应用是一个主要障碍。然而,愈伤组织诱导率在过去的十年中已有较大的提高。中国科学院植物细胞和组织培养研究室的研究人员(1975)把蔗糖浓度从6％增加到12～     

小麦WRKY转录因子的鉴定及其在胚性愈伤组织形成中的表达分析

为研究WRKY转录因子在小麦胚性愈伤组织形成中的功能,以小麦基因组信息和愈伤组织形成发育过程中的转录组数据为基础,利用生物信息学方法,在全基因组范围内进行小麦WRKY转录因子的鉴定,并对小麦胚性愈伤组织形成过程中TaWRKY基因的表达模式进行分析.结果表明,在全基因组范围内共鉴定到270个小麦WRKY转录因子(TaWR...     

小麦遗传转化中潮霉素筛选体系的建立及应用

为建立小麦遗传转化中高效的潮霉素筛选体系,以小麦品种郑麦9023的幼胚愈伤组织为材料,探讨了潮霉素浓度、处理时间、恢复培养与否对愈伤组织分化和再生的影响,并对基因枪转化的郑麦9023、邯6172、龙麦30、龙麦31的愈伤组织进行了筛选。结果表明,对小麦幼胚愈伤组织基因枪遗传转化后的筛选以50mg·L-1潮霉素处理30d为宜;恢复培养不能提高筛选阶段愈伤组织的存活率和分化率,但能提高转化后期的成苗率。经过筛选发现郑麦9023抗性愈伤和T0代抗性植株根系及花器官中均有GUS基因的表达;4个小麦品种抗性植株中潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和候选基因PCR阳性率分别为78.95%和73.68%以上;龙麦30、龙麦31的T1代植株的候选基因PCR阳性率分别在33.33%和73.33%以上,T2代阳性率分别在71.43%和75.00%以上。     

玉米愈伤组织的遗传转化和对草丁膦抗性及植株再生的研究

以玉米自交系7922、P2和H99的胚性愈伤组织为材料,通过愈伤组织对草丁膦的敏感性实验,确定愈伤组织适宜选择压,并探讨了不同激素对愈伤组织分化的影响,用带有质粒PGBIloxAp.Bt.35sp.bar的根癌农杆菌LBA4404转化玉米愈伤组织,PCR检测证明,目的基因已整合到玉米基因组中。     

利用流式细胞术鉴定茉莉花基因组大小和染色体倍性

以收集的16份茉莉花资源及50份实生种质为材料,以玉米B73为内参,采用流式细胞术估测茉莉花基因组大小,并以二倍体品种为对照,计算茉莉花染色体倍性。结果表明:内参与待测样品峰值能完全分开,无重叠峰,峰型清晰集中,可对茉莉花基因组大小进行有效估测;供试材料中有56份二倍体,基因组大小为0.54～0.63 Gb,有7份三倍体,基因组大小为0.79～0.96 Gb,有3份四倍体,基因组大小为1.04～1.12 Gb;从收集的资源中鉴定出二倍体和三倍体,未见四倍体,而从实生种质中鉴定出3个四倍体、2个三倍体,表明实生选种是茉莉花种质创新的一条有效途径;在已明确花冠类型的材料中,三倍体及四倍体均为单瓣型茉莉。该研究结果为茉莉花倍性育种及实生选种提供科学依据。     

茉莉花香气相关基因JsTPS启动子的克隆与活性分析

以茉莉(Jasminum sambac)的花苞为材料,采用染色体步移技术,分离出JsTPS基因的5'端调控序列,对该启动子序列进行顺式作用元件预测.根据茉莉花TPS基因启动子的顺式作用元件分布,扩增出5个不同片段长度的启动子,分别命名为JsTPS-1(494 bp)、JsTPS-2(689 bp)、JsTPS-3(10...     

茉莉花白绢病露天接种技术及盆栽抗病性鉴定

为了鉴定茉莉花资源对白绢病的抗性,从主产区广西横县的病株分离白绢病菌株,以横县双瓣茉莉花为材料,对露天条件下茉莉花白绢病接种方法进行了研究,并对盆栽的不同茉莉花品种(系)进行接种,采用相对抗病程度评价法鉴定供试材料的抗病性.结果表明:(1)在5种接种方法中,带菌燕麦粒埋土法的病情指数、发病率最高,分别为47.93％、8...     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

菠萝MYB基因AcoMYB1的克隆与表达分析

根据菠萝转录组的测序结果克隆到1个MYB转录因子基因,命名为AcoMYB1,GenBank登录号为XM₀20230319。该基因cDNA全长1221 bp,开放阅读框(ORF)为747 bp,编码一个含有248个氨基酸的蛋白。序列分析表明,AcoMYB1氨基酸序列N端具有2个保守的SANT结构域,属于R2R3类MYB转录因子。生物信息学分析表明,AcoMYB1是不稳定的亲水蛋白,不具有跨膜结构和信号肽,可能定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。实时荧光定量PCR分析表明,AcoMYB1在菠萝干旱、低温逆境胁迫处理下受诱导表达,整体上表现出"先升后降"的趋势;在早熟品种和晚熟品种的果实发育过程中也被诱导表达,表现为"升-降-升"的趋势,特别是在果实发育早期和果实成熟后期受诱导表达的强度较为突出。由此推测AcoMYB1作为正调控因子参与菠萝冷害、干旱逆境胁迫的响应过程,并在菠萝果实早期发育及后期成熟发挥调控作用。     

椰子CnRADIALIS-like转录因子的克隆与表达分析

本研究依据前期已经完成的4个品种椰子外果皮转录组测序数据结果,筛选获得在4个品种椰子外果皮中表达水平显著差异的MYB类基因CnRADIALIS-like。从椰子（Cocos nucifera L.）外果皮中克隆获得CnRADIALIS-like,序列分析显示,CnRADIALIS-like基因的开放阅读框（ORF）长288 bp,编码95个氨基酸。结构域分析显示,CnRADIALIS-like含有1个典型的SANT/MYB结构域,属于MYB转录因子家族中的I-box-binding-MYB型。多序列比对发现,CnRADIALIS-like氨基酸序列与油棕MYB-RADIALIS（RAD）氨基酸序列相似度最高。理化性质、亲/疏水性和无序化分析显示,CnRADIALIS-like转录因子是亲水性蛋白且偏碱性,存在无序化区域。信号肽和跨膜结构域分析表明,其不存在信号肽和跨膜结构域。空间结构分析显示,CnRADIALIS-like有典型的α-螺旋结构。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）显示,CnRADIALIS-like基因在4个品种椰子外果皮中的表达量存在显著差异,在红矮椰子中表达量最高,红矮椰子不同组织中在外果皮表达量最高。该基因的表达在红矮椰果从幼果至成熟果的3个发育阶段依次降低,套袋条件下表达量低于正常光照条件下,表明该基因可能与光形态下细胞发育及代谢产物合成存在相关作用。通过对该基因的生物信息功能进行分析,为深入研究其功能及作用机制提供参考,同时以期为深入剖析椰子的外果皮颜色形成机制提供重要的理论依据。     

大豆E3连接酶基因GmPLR-2 的克隆及抗旱功能鉴定

PEG模拟干旱胁迫条件下E3连接酶GmPLR-2 基因在大豆根茎叶中呈上调表达,推测其可能参与大豆抗旱调节。本研究克隆GmPLR-2 基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPLR-2、RNA干扰表达载体pCAM⁃BIA3301-GmPLR-2-RNAi并转化到吉农38中,对T2转基因植株进行分子检测,连续7 d不浇水后测定转基因叶片中相关生理生化指标。结果表明：共获得T2过表达阳性植株12株,RNA干扰阳性植株11株。干旱胁迫7 d后过表达植株中相对含水率、POD活性、SOD活性、Pro含量均高于未转化植株,而RNA干扰植株中则低于未转化植株;另一方面过表达植株中相对电导率、MDA含量均低于未转化植株而RNA干扰植株中含量则高于未转化植株,且差异极显著,说明GmPLR-2 基因的表达与大豆中相关抗旱指标的变化有关。     

甘蔗梢腐病菌Fusarium sacchari CYP51基因克隆及遗传转化

甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是生物细胞膜合成所需的一个非常重要的酶,在病原菌的耐药性、致病性和生长繁殖等方面发挥着非常重要的作用。研究表明干扰真菌的CYP51基因表达导致其无法正常生长,显著降低其致病性。本研究以甘蔗梢腐病菌甘蔗镰刀菌（Fusarium sacchari）为试验材料,根据基因组测序数据设计特异性引物克隆得到了FsCYP51基因全长和CDS全长。生物信息学分析表明,该基因序列全长1947 bp,编码区由2个内含子和3个外显子组成,CDS全长1554 bp,编码517个氨基酸,编码蛋白理论相对分子量为58.61 kDa。其编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,具有典型的CYP51保守结构域。预测其亚细胞定位于细胞膜,且存在2个跨膜区域。系统进化分析表明,FsCYP51基因属于CYP51C这一类,与串珠镰刀菌（F. verticillioides）的CYP51C基因亲缘关系最近。同时,根据克隆到的基因全长和CDS全长构建了多价HIGS植物表达载体,并利用基因枪介导的遗传转化方法将干扰片段成功转化至甘蔗受体材料,为研究FsCYP51基因功能和创制抗梢腐病甘蔗种质奠定基础。