橡胶树sHSP基因家族的表达谱分析

小热激蛋白（small heat shock protein, sHSP）是一类胁迫诱导蛋白,不仅参与植物发育还响应生物与非生物胁迫。本研究通过分析转录组数据获得橡胶树12个sHSP基因家族成员。生物信息学分析和表达谱分析结果表明：蛋白保守结构预测显示12个sHSP均具有α-晶体蛋白保守结构域;二级结构预测结果显示,12个sHSP均由α-螺旋、β-转角、延伸链和大量的随机卷曲组成。通过RT-PCR技术分析,结果发现这12个sHSP家族基因在橡胶树不同组织和叶片不同发育时期中表达有明显差异,HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.5、HbsHSP22.6和HbsHSP23.9在胶乳中高表达,HbsHSP17.4在树皮中高表达,HbsHSP17.5a在树茎中高表达,HbsHSP25.8则在树叶中表达量最高。乙烯利处理后,12个sHSP家族基因的表达总体呈下降趋势。在不同死皮等级橡胶树中12个sHSP家族基因的表达也具有明显差异,与健康树相比,HbsHSP15.8、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.6、HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在死皮树中的表达量呈下降趋势;HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和HbsHSP22.5的表达量呈上升趋势。因此推测橡胶树sHSP家族基因可能参与橡胶树生物与非生物逆境胁迫响应,以及可能在乙烯作用途径中发挥作用。     

巴西橡胶树肌动蛋白的原核表达及鉴定

肌动蛋白细胞骨架是橡胶树乳管伤口堵塞物的成分之一.为了研究乳管伤口末端与肌动蛋白互作的蛋白,成功构建了ACTIN基因的原核表达载体.在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导2h,在E.coil BL21(DE3)中大量表达重组蛋白.该重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子量41.7ku.通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了该重组蛋白,并用抗HIS标签的鼠单克隆抗体对纯化蛋白进行鉴定.本研究为揭示乳管伤口末端堵塞物形成机制打下了良好基础.     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因(HbACO7)的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

巴西橡胶树乳管肌动蛋白细胞骨架与采胶的关系

以成龄巴西橡胶树为材料，用免疫印迹技术研究了胶乳中的肌动蛋白，并用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光探针检查了乳管伤口的肌动蛋白细胞骨架。割胶后收集的胶乳，经超速离心分离的各个组分中，C乳清(胞质溶液)组分含有肌动蛋白。排胶初始期流出的胶乳中肌动蛋白含量多，排胶后期流出的胶乳中肌动蛋白的含量减少。比较了不同割胶强度下收集的胶乳中肌动蛋白的含量，结果表明在强度割胶条件下，胶乳中的肌动蛋白含量较少。用显示肌动蛋白微丝的鬼笔环肽荧光探针检测到，停止排胶时的乳管伤口末端有一团呈现橙红色的荧光物质，表明了肌动蛋白微丝在伤口末端聚积。进行了外施肌动蛋白微丝的解聚剂大环内脂和碘化钾刺激采胶试验，结果表明：施用质量分数1％的碘化钾和饱和浓度的大环内酯水溶液能使胶乳产量增加。这些事实表明，肌动蛋白细胞骨架可能在橡胶树乳管排胶和乳管堵塞中起重要作用。     

巴西橡胶树氰丙氨酸合成酶基因HbCAS的克隆与表达分析

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase,β-CAS）是植物氰化物解毒的关键酶,在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从巴西橡胶树中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS,并对其进行分析。结果表明：HbCAS基因开放阅读框长为1113 bp,编码370个氨基酸,其理论分子量为40.15 kDa,等电点为8.90,属于色氨酸合成酶超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,HbCAS基因在橡胶树各种组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高。同健康树相比,HbCAS基因在死皮树中的表达显著下调。过氧化氢及乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸及脱落酸等多种激素均能调控HbCAS基因的表达。同时,HbCAS基因的表达也受干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫调节。本研究结果揭示HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中起重要作用。     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

乙烯利对橡胶树乳管伤口堵塞相关蛋白基因表达和含量的影响

乳管伤口堵塞物的形成决定着排胶时间的长短,乙烯利刺激能显著延长排胶时间,但目前关于乙烯利刺激对乳管堵塞物的影响研究很少。以橡胶树无性系PR107为材料,利用荧光定量PCR和蛋白质Western-blot研究了乙烯利刺激对黄色体内含物相关蛋白的基因表达以及蛋白(包括黄色体和C-乳清中)的含量变化的影响,同时利用光学显微技术研究了割口表面蛋白质网形成的情况。结果表明:乙烯利刺激后PR107胶乳中HGN 1、Hevamine A及HEV 1这3个基因的相对表达量均显著性降低;黄色体中和C-乳清中对应的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及橡胶素蛋白含量也显著性降低;而割口处割面形成的蛋白质网明显多于对照橡胶树,且随着排胶时间的延长蛋白质积累增多。     

茶树GAGP基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得GAGP基因长3β146βbp（GenBank,登录号KJ946251）,具有2β769βbp开放阅读框（1^st~2β769^th）,编码923个氨基酸。分子生物信息学分析表明,GAGP蛋白分子量约106.9βkD,等电点为8.42,定位于线粒体内。定量PCR分析表明,GAGP在茶树叶片中表达强度存在明显的品种差异,GAGP对生物性和非生物性胁迫均有明显响应。     

茶树根系Actin基因克隆及表达分析

采用SSH技术分析了VA菌根处理后福鼎大白茶根系基因差异表达情况,获得了差异序列,序列比对显示,在下调表达序列中可能包含了10种未知功能的基因;在上调表达序列中可能包含了5种可能的基因。采用RACE技术获得了Actin基因全长序列,Actin基因长1β606βbp (GenBank, 登录号KJ946252),具有1β131βbp开放阅读框（1^st~1β131^st）,编码377个氨基酸。分子生物信息学分析表明,Actin蛋白分子量约30.69βkD,等电点为5.27,定位于细胞核等亚细胞区位。研究还显示,Actin在不同品种中表达无显著差异,对非生物性胁迫响应也较弱。     

巴西橡胶树乳管伤口堵塞物形成调节的研究进展

巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源,割胶是从橡胶树中获取天然橡胶的唯一途径。割胶后乳管伤口堵塞物的形成使排胶速度迅速降低,产量减少。对堵塞物的形成和调控的研究不仅具有重要的理论意义,也具有重要的应用价值。本文从堵塞物对排胶的影响、堵塞物的成分、堵塞物形成和调控的相关因素等方面进行了综述,为橡胶树排胶生理学的深入研究提供参考。     

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。     

巴西橡胶树MADS-box基因家族6个成员的染色体物理定位

MADS-box基因家族广泛分布于真核生物中,巴西橡胶树的MADS-box基因家族主要参与花形态建成,对生殖生长起到重要的调节作用。目前,MADS-box基因家族的26个相关基因已被克隆分析,但它们在染色体上的具体位置还未确定。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’品种为材料,将MADS-box基因家族的6个成员（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1）定位在细胞核染色体上,通过双探针荧光原位杂交技术（FISH）对巴西橡胶树MADS-box基因家族的这6个成员在细胞核染色体上进行物理定位分析。结果表明：MADS-box基因家族的6个基因分别位于不同的染色体上,其中HbAGL15、HbAG8、HbAG30和HbSVP1基因定位在第4、5、7和8号染色体长臂上,其信号位点到着丝粒的平均百分距离是11.85、39.71、48.94和6.70;HbTT16和HbAP1基因定位在第1和13号染色体短臂上,其信号位点到着丝粒的平均百分距离是22.19和18.01。本研究结果揭示了巴西橡胶树MADS-box基因家族的6个成员在细胞核染色体上的实际位置,展现家族基因之间的分布特点和连锁遗传关系,不仅丰富了橡胶树分子细胞遗传学信息,也为橡胶树的分子辅助育种和比较基因组学研究提供了分子细胞遗传学的科学理论依据。     

橡胶树KT/HAK/KUP基因家族成员的鉴定与表达分析

为研究巴西橡胶树钾转蛋白(KT/HAK/KUP)基因家族在生长发育和逆境胁迫方面的生物学功能,从橡胶树基因组中鉴定得到31个KT/HAK/KUP基因家族成员,并从基因结构、染色体定位、系统进化和表达分析等方面进行全面系统的分析.研究结果发现,KT/HAK/KUP基因家族31个成员分布在3个Contig和15个染色体上,...     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

不同种质非刺激割制下胶乳总蛋白质年度变化

胶乳中的蛋白质对橡胶生物合成、胶乳稳定性和加工性能等方面有重要影响,但总蛋白质含量在不同种质间的差异及其年度变化未有系统研究。本研究以国家橡胶树种质资源圃种植的少花橡胶、光亮橡胶、巴西橡胶野生种和栽培种共13份种质为对象,于2018—2019年对总蛋白质含量及其年度变化进行分析研究。结果表明：胶乳总蛋白质含量为0.147~0.174 g/kg,在种质间的差异达到极显著水平。根据总蛋白质含量水平,可初步分为3类,大于0.17 g/kg的高蛋白质含量类,低于0.15 g/kg的低蛋白质含量类和蛋白质含量为0.15~0.17 g/kg的中间类型。总蛋白质含量在父/母本与子代间也可很好地区分,适合作为胶乳特性指标。总蛋白质含量5月下旬下降,11月中旬上升,其他时间则差异不显著。胶乳总蛋白质含量可采取每月下旬或代表性月份6月、8月、10月测定。干总比大多为89%~97%,年度变化上呈现逐步下降的趋势,有2个低凹期,即5月下旬和10—11月,间接反映这2个时期非胶组分较高,推测5月下旬和10月份非胶组分的上升与总蛋白质无关。     

巴西橡胶树YABBY基因家族鉴定及表达分析

YABBY基因家族是一类植物特有的转录因子,在植物叶片和花器官的发育以及非生物胁迫应答中起重要的调控作用。本研究从橡胶树基因组中鉴定得到11个HbYABBY家族成员,并从基因结构、启动子顺式作用元件、染色体定位、系统进化及基因表达等方面进行分析。结果显示11个橡胶树HbYABBY基因分布在9条染色体上,编码蛋白的长度在132~241个氨基酸,分子量在14.75~26.41 kDa,启动子区域含有丰富的光响应元件。该基因家族具有显著的组织表达特异性,叶片和花中高表达,而在胶乳和根中基本不表达。叶片的发育过程中,除HbCRC1上调表达,另外9个HbYABBY基因均显著持续下调表达,表明HbYABBY深度参与橡胶树叶片发育调控。转录组测序和荧光定量检测均发现所有HbYABBY成员受高温诱导持续下调表达,但不受低温胁迫诱导,暗示了HbYABBY在橡胶树的高温胁迫中发挥调控作用。本研究以热带经济林木巴西橡胶树为研究对象,对YABBY转录因子基因家族的理化特征、表达及功能进行了初步分析,为该基因家族功能的深度研究提供了理论依据和参考。     

橡胶树魏克汉种质成龄树经预割诱导后次生乳管分化的比较

巴西橡胶树树干中次生乳管列的多少与胶乳产量密切正相关,而割胶伤害能诱导次生乳管分化。分析不同魏克汉种质成龄树在预割伤害后树皮次生乳管的分化,不仅为不同种质鉴定和评价提供依据,也为成龄大树割胶后次生乳管分化能力提供预测。采用碘-溴染色方法和石蜡切片技术,对不同种质材料新分化的次生乳管进行了统计分析。研究结果表明,选取的110份魏克汉种质预割后新分化的次生乳管列数不同,具有明显的种质特征。根据分化次生乳管列数的多少,将预割诱导乳管分化的级别由低到高分为1、2、3、4级。在110份种质中,对应1级32份、2级49份、3级24份和4级5份的种质,所占比例分别为29.09%、44.55%、21.82%和4.55%,可见,分化能力强的种质占比较低,大部分种质为2级乳管分化。国外直接引种和国内自主选育的种质在预割诱导分化能力上也存在差异。在110份种质中,国外引种58份种质中对应分化能力1、2、3、4级的种质占比分别为29.31%、44.83%、22.41%以及3.45%;国内选育的52份种质中对应1、2、3、4级的种质占比分别为28.85%、44.23%、21.15%和5.77%;可见,国内选育种质受预割诱导乳管分化的能力优于国外引种的种质,尤其是4级分化能力的种质比例明显高于国外引种的种质。不同系列来源的种质乳管分化能力也存在差异,其中,国外PB、RRIM和RRIC系列和国内的大岭、海垦和大丰系列表现出较强的乳管分化能力。比较分析2个杂交组合后代的乳管分化情况发现,PB86×PR107的4份子代中次生乳管有3份为3级,1份为4级,后代表现出较强的乳管分化能力;而RRIM600×PR107的6份子代中1级2份,2级2份,3级2份,可见其后代乳管分化能力略差。PB86和PR107后代的乳管分化表现出较强的双超亲现象,可作为优良的育种亲本。通过预割判断乳管分化能力不仅为魏克汉种质鉴定和评价奠定基础,也为橡胶树高产育种以及早熟、晚熟品种的早期预测提供有效指标。