水稻花粉小肽锌指蛋白基因OsFLZ13功能研究

FCS样锌指蛋白(FLZ)与植物的生长发育和逆境胁迫反应相关。水稻的FLZ基因家族分析和功能研究较少。本研究利用TBtools对水稻基因组Blast,鉴定到29个OsFLZ家族基因成员,并分析了相关基因位置、基因结构、motif和启动子顺式作用元件等特征。随后,通过水稻CREP数据库研究了FLZ家族成员的全生育期组织表达模式,并发现其中的OsFLZ13基因在开花前的花药中特异高水平表达。随后β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色显示,OsFLZ13在花药发育的第8阶段开始表达,并在开花前的第14阶段表达量最高。用CRISPR/Cas9基因编辑获得的突变体植株结实率显著下降。相比野生型中花11的94%结实率,Osflz13-1和Osflz13-2的结实率分别只有44%和36%。本研究表明OsFLZ13参与花药发育以及花粉育性的调控,为进一步研究该基因及其家族基因的功能提供参考,同时对水稻雄性不育利用具有潜在的价值。     

水稻基因OsASIE1抗逆功能分析

作为重要的植物转录因子家族, AP2/EREBP转录因子在植物发育、激素、病原反应及非生物胁迫如干旱、高盐、低温应答方面起重要作用。本研究发现水稻AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚家族成员OsASIE1 (abiotic stress induced EREBP gene)在水稻受到高盐、干旱胁迫时表达量迅速提高, 并且在水稻中超表达OsASIE1能够改善水稻抵抗盐胁迫的能力。凝胶迁移率实验(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)表明该转录因子的AP2结构域能够结合干旱应答顺式作用元件DRE (dehydration-responsive element)和乙烯应答元件GCC box (ethylene response element), 推测OsASIE1可能通过结合DRE和GCC box 作用元件调控下游相关基因的表达, 进而调控相关抗逆反应。     

杜梨PbGID1家族基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及遗传转化

为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现,PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_35S-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株。     

水稻CNGCs家族的鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

为了解水稻CNGCs家族成员的基因结构、进化特征、亚细胞定位、启动子顺式作用元件和生物学功能,本研究利用生物信息学的手段对水稻CNGCs家族进行鉴定,运用RT-qPCR的方法分析OsCNGCs在非生物胁迫下的诱导表达模式。结果表明,水稻共有16个CNGCs,分布在1、2、3、4、5、6、9和12号染色体上。进化树分析显示OsCNGCs可分为4个大组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ),而Ⅳ组可以细分为Ⅳ-A和Ⅳ-B 2个亚组。OsCNGCs启动子区域存在多种顺式调控元件,包括各种类型的光响应元件、厌氧诱导响应元件、逆境相关转录因子结合元件、防御和逆境响应元件、低温响应元件以及各种植物激素响应元件等,暗示OsCNGCs在响应多种激素和非生物胁迫中可能存在重要调控作用。多种非生物胁迫诱导表达分析表明,大多数OsCNGCs基因表现出明显的差异表达。本研究为解析CNGCs家族基因在水稻应对非生物胁迫中的功能提供了参考。     

基于CRISPR/Cas9技术对水稻ALOG家族成员的基因敲除突变体的构建

ALOG (Arabidopsis LSH1 and Oryza G1)基因家族成员广泛存在陆生植物中,并在其生长发育的过程中起到关键作用。在水稻ALOG基因家族中总共有10个成员(G1, G1L1～G1L9),G1、G1L5和G1L6已经被证明是影响水稻花发育的关键基因,然而其余7个基因成员的功能还未知。本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对水稻ALOG基因家族功能未知的7个成员进行基因敲除,得到它们的突变株系,借此研究它们的基因功能并观察植株表型。在得到的所有T0代突变体植株中,G1L1、G1L2、G1L3、G1L8和G1L9经过测序和解码已经检测到各自纯合的突变株,经过对纯合突变株基因型和氨基酸序列的分析发现,它们各自的序列都发生移码并且编码的氨基酸序列都存在不同程度的突变,说明基因敲除成功。通过对T0代纯合植株的表型观测,我们在G1L1和G1L2的纯合突变株中发现了穗发育缺陷的表型,即主穗轴变长,且上面的小穗变少。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻ALOG基因家族成员进行敲除,为进一步研究水稻发育尤其是水稻花发育调控分子机制提供了重要的遗传材料。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。     

甜橙PEBP基因家族的鉴定及在成花过程的表达分析

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein, PEBP)基因家族的氨基酸结构中有保守的磷脂酰乙醇胺结合蛋白结构域,对控制植物花器发育和开花时间具有重要作用。本试验旨在研究CsPEBP基因家族对甜橙花期诱导的调控模式,利用PEBP蛋白特征结构域PBP的隐马尔可夫模型在甜橙基因组中进行HMMER分析,鉴定出7个Cs PEBP基因,并对CsPEBPs编码蛋白的理化性质、蛋白基序、进化关系、顺式调控元件和表达谱等方面进行研究。结果表明CsPEBPs分布在甜橙5条染色体上。遗传进化树聚类成4个亚族,CsPEBP基因家族成员被分在TFL1-subclade、MFT-subclade、FT-subclade 3个亚族中。7个CsPEBP基因均含有光响应元件,表明CsPEBPs受光诱导调控。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析发现,CsPEBP基因在两个甜橙品种花芽和叶片的表达模式不同,其中CsFT1和CsFT2在两甜橙品种花芽和叶片中的相对表达量均有显著上调的趋势,而CsTFL1a、CsTFL1b和CsTFL1c在它们花芽和叶片中的...     

甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因SbSEC14的克隆及低温胁迫下的表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(PITPs)广泛存在于真核生物细胞中,能够在体外膜脂质双层之间调控磷脂酰肌醇(PtdIns)或者磷脂酰胆碱(PtdCho)单体的独立转运。参与磷酸肌醇代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫、胞浆运动和细胞周期调节等多种重要的生命过程,在植物的逆境响应以及发育调节中具有重要的作用。为了研究甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因及其在低温胁迫下的表达情况。本研究以甜菜基因组数据库中一条预测的磷脂酰肌醇转运蛋白基因CRS1为模板,用基因克隆的方法得到一条全长765 bp,开放阅读框596 bp,编码198个氨基酸的甜菜SEC14基因,命名为SbSEC14。理化性质分析表明,该蛋白质为不稳定亲水蛋白;蛋白质二、三级结构分析表明,该蛋白质α-螺旋所占的比例最高,为47.47%,β-转角所占比例最低,为5.56%;蛋白质保守结构分析表明,该蛋白质有典型的SEC14结构域;蛋白质系统进化树分析表明,甜菜SbSEC14基因与菠菜、藜麦的磷脂酰肌醇运转蛋白基因亲缘关系最近;实时荧光定量结果表明,SbSEC14基因在甜菜中组成型表达,在甜菜叶中的表达量最高,在甜菜根中的表达量最低,在叶中表达量约为根中的2.5倍。甜菜幼苗4℃处理0、2、6、12、24 h,该基因在植株处理0~2 h时表达量呈上升趋势,在植株处理2~6 h时表达量呈下降趋势,在植株处理6~24 h时表达量趋于平稳状态。因此,预测该基因与甜菜抗低温胁迫相关。     

CRISPR/Cas9系统在稻米品质改良中的应用

目前稻米品质改良已成为水稻育种的重要目标。稻米品质主要包括外观、加工、蒸煮食味和营养品质,由极其复杂的基因调控网络决定。CRISPR/Cas9系统作为新发展的定向基因编辑系统为水稻品质改良提供了重要的技术支撑,该系统具有操作简单、编辑效率高、易于多基因编辑等优点。本研究结合CRISPR/Cas9基因编辑系统及稻米品质相关基因的研究进展,详细介绍了CRISPR/Cas9基因编辑系统在稻米品种改良中的应用,讨论了该技术在水稻品质改良中存在的问题和改进策略,旨在为利用CRISPR/Cas9技术创制优质水稻新品种提供参考。     

植物PDCT基因家族的鉴定与生物信息学分析

磷脂酰胆碱甘油二酯胆碱磷酸转移酶(phosphatidylcholine diglyceride choline phosphotransferase,PDCT)参与植物种子甘油三酯(triglyceride, TAG)的合成,促进磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine, PC)与二酰甘油(diacylglycerol, DAG)间的相互转化,其酶活的丧失显著减少种子多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的积累。本研究通过生物信息学的手段,利用已公布在数据库中的6种油料作物(花生,甘蓝型油菜,大豆,陆地棉,芝麻和向日葵)、2种粮食作物(水稻和玉米)及1种水生植物(中国莲)的基因组信息,从中鉴定出20个PDCT同源基因,并对它们的理化性质、染色体分布、基因结构、系统进化及启动子序列分析等进行进一步的研究。结果表明,植物PDCT家族在进化上具有一定的保守性,体现在稳定的蛋白质性质和结构、保守的基因结构、保守的进化距离和保守的结构域等方面;植物PDCT家族基因拷贝数存在明显差异,受测的粮食植物及拟南芥都只有单拷贝,而受测的油料作物则几乎都是多拷贝(2个或以上);植物PDCT家族基因的表达可能受到多种发育和环境(特别是光)胁迫信号的影响,它们的启动子区域均存在很多的转录核心启动子元件及光响应顺式作用元件。本研究结果为进一步研究PDCT家族基因的育种应用提供了生物信息学参考。