黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT－PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV－PE）全长RNA3。经核苷酸序列测定，明确PE分离物RNA3全长2216nt，含有2个开放阅读框（ORDF），其中5'端的ORF（121－963nt)编码279aa的3a蛋白，3'端ORF（1260－1916nt)编码218aa的CP蛋白。5'端非编码区（NR）长120nt，基因间隔区（IP）长296nt，3'端NR区含301个碱.PE分离物编码的3a蛋白最明显的特征是在136－141位有一个独特的VWCLSS区域，将CMV－PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码 区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

侵染胡椒的黄瓜花叶病毒海南分离物全序列分析及亚组鉴定

对侵染海南胡椒的3个黄瓜花叶病毒分离物(CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT)的全序进行克隆和分析。CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT分离物RNA1全长分别为3 361,3 360,3 359个核苷酸(nt),编码1a蛋白;RNA2全长分别为3 044,3 048,3 046 nt,编码2a和2b蛋白;RNA3全长分别为2 217,2 224,2 216 nt,编码3a和CP蛋白。序列一致性比较结果表明,CMV-WN1,CMV-DA,CMV-FT的RNA1,RNA2,RNA3均与CMV亚组IB CMV-SD序列一致性最高,编码的所有蛋白的氨基酸序列一致性也均与CMV-SD序列一致性最高,其中除了2b氨基酸序列一致性低于90%外,其他蛋白的氨基酸序列的一致性均高于93.5%。RNA3的5'NTR结构分析以及RNA3 5'NTR核苷酸序列和CP氨基酸序列系统进化树分析结果表明CMV-WN1,CMV-DA及CMV-FT均属CMV IB亚组。CP系统进化树中CMV-WN1,CMV-FT与云南胡椒分离物CMV-YNP聚成一簇,而CMV-DA与海南胡椒分离物CMV-HNP独立形成另一个分支。     

烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物基因组全长序列测定和结构分析

[目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组进行比较分析。[结果]烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组全长序列一致性为95.4%;ORF1a编码产物的氨基酸序列一致性为93.1%;ORF1b编码产物的氨基酸序列一致性为98.3%;3’端非编码区的核苷酸序列一致性为95.5%。[结论]该研究为研究TBTDaRNA的分子变异奠定了基础。     

黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星RNA的克隆及其与12个卫星RNA核苷酸序列的比较

对一株分离自萝卜（Raphanussativus）的黄瓜花叶病毒(CMV)卫星RNA(Rs)进行了cDNA克隆与序列确定，并与12个已知的卫星RNA序列进行了比较。结果表明：卫星RNARs的大小为368nt；该卫星RNA所比较的13个卫星RNA的大小分布为334～405nt，可分为3个组和4个亚组；CMV卫星RNA的序列同源性和分组与卫星RNA的大小并无直接联系。卫星RNA序列之间的连续缺失和插入均集中在90～255nt间几个邻近的区域。在卫星RNA二级结构中的非配对区序列、卫星RNA的5'端近80个碱基和3'端近45个碱基相当保守。由此推测CMV卫星RNA的理论长度可达446nt。序列结构的比较显示，CMV卫星RNA具有作为外源基因载体的潜力。     

甜菜坏死黄脉病毒不同分离物三联基因区及RNA3的序列分析

以来自于我国内蒙古、黑龙江和宁夏的3个甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）分离物为材料,采用反转录－PCR方法扩增不同RNA组分的基因片段,经cDNA克隆和序列测定后,与国外报道的BNYVV不同株系和来自于我国不同地区的BNYVV分离物之间进行比较分析。结果表明,BNYVV内蒙呼和浩特分离物（HU）RNA2中的42kD至3'端蛋白编码区长度为2435个核苷酸（nt),与法国F2分离物、德国G1分离物、日本S分离物的一致性分别为97．7％,94．9％;而黑龙江（HEI）、宁夏（NIN）和内蒙古包头分离物（BAO）RNA3的25kD蛋白编码区则与以往报道的内蒙呼和浩特分离物（HU）相应片段分别具有95．4％,93．4％和94．0％4的一致性,这些差异进一步证明了在BNYVV分离物之间广泛存在的分子变异,并可能与它们的致病能力相关。     

莴苣花叶病毒北京分离物基因组3＇末端序列分析

笔者通过RT-PCR方法对LMV北京分离物(LMV-BJ)基因组3''端1620nt的核苷酸片段进行了克隆和序列分析(GenBank登录号为EF423619)。所获片段含有NIb基因3''端的574nt,编码NIb C-端190个氨基酸;完整的CP基因,全长为834nt,编码一个由277个氨基酸组成的分子量约为30kDa的结构蛋白;3''非编码区含有209nt。通过序列分析软件将LMV-BJ与已经报道的法国分离物O(X97704)、法国分离物E(X97705),美国分离物(X65652),巴西分离物(AJ278854)和余杭分离物(AJ306288)基因组3''末端和CP基因的核苷酸序列与氨基酸序列分别进行了比较。     

侵染广州番木瓜的曲叶病毒DNA-A分子特征及生物学测定

 从中国广州番木瓜上检测获得双生病毒分离物GT，核苷酸序列测定表明，GT分离物 DNA-A全长2 769个核苷酸，编码6个ORFs，其中病毒链编码AV1（CP）和AV2两个ORFs，互补链编码AC1～AC4四个ORFs。DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较表明，GT与广东番木瓜曲叶病毒分离物GD2亲缘关系最近（96.7％）。生物学初步测定表明，该病毒可通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播到番木瓜、烟草和番茄植株上。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

黄瓜花叶病毒丹参株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析

从河北安国具有典型花叶症状的大田丹参叶片中分离到病毒病原 ,经过生物学接种、电镜观察和酶联免疫吸附测定表明该离物与CMV有较近的亲缘关系 (记为CMV DS)。从叶片中提取了该病毒的总RNA ,按照CMV外壳蛋白 (CP)基因前后保守区序列 ,设计合成了 1对特异引物 ,采用RT PCR法扩增了 780bp的全长CP基因的cDNA序列 ,将其克隆到pGEM T载体上 ,并进行序列分析。结果重组克隆序列长为 778bp ,含 1个开放阅读框架 (ORF) ,长度为 65 7nt,编码 2 1 8个氨基酸组成的蛋白。与国内外报道的CMV株系序列比较 ,CMV DS和亚组Ⅰ株系的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性为 93 3%～ 99 4%和95 9%～ 1 0 0 % ;而与亚组Ⅱ株系的核苷酸和氨基酸序列同源性仅为为 78 4%～ 79 0 %和81 2 %～ 83 0 % ,表明CMV DS与CMV亚组Ⅰ的株系较亚组Ⅱ株系同源关系更密切 ,将其划归为CMV亚组IB中 ,这是首次在丹参上发现的CMV株系。     

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)O株系中国分离物(SPFMV-O-Ch1)和RC株系中国分离物(SPFMV-RC-Ch1)的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 ...     

黄瓜花叶病毒M株系全序列测定

在定向克隆和序列分析试验中,白肋烟(Nicotiana tabacumcv.white Burley)为繁殖寄主,根据美国NCBI核酸数据库中CMV基因组RNA1,RNA2和RNA3基因序列,共设计3对特异性引物。对3对特异性引物进行PCR扩增,分别得到3.3 kb的RNA1、3.0 kb的RNA2和2.2 kb的RNA3 PCR扩增产物。M-CMV基因组cDNA经过序列测定,3条链的长度分别为:M-CMVRNA1全长3 361 bp,分子量为111 kDa的1a蛋白;RNA2全长3 037 bp,含有两个分子量为96.7 kDa的2a蛋白和分子量为13.1 kDa的2b蛋白;RNA3全长2 215 bp,分别编码分子量为30.5 kDa的3a蛋白和分子量为24 kDa的外壳蛋白(cp)。这是继国内CMV-CD、CMV-CA全序列报道之后的首次M-CMV全序列分析,为以后采用基因突变、置换方法观察寄主的症状变化做了前期工作。     

甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

为了制备甘薯卷叶病毒(SPLCV)的特异性抗体,克隆了甘薯卷叶病毒江苏分离物SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全长基因,并对其基因结构及分子变异情况进行分析,同时对外壳蛋白(CP)基因进行了克隆和表达。利用PCR方法扩增并克隆了SPLCV(JS∶XZ∶3-2)的全基因组,测序分析表明,SPLCV(JS∶XZ∶3-2)基因组全长为2 834bp,含有6个开放阅读框架,与已发表的SPLCV其他分离物相比,全基因组核苷酸序列相似性为82.7%～94.4%。其中,CP基因由765个核苷酸组成,共编码254个氨基酸残基。SPLCV CP基因核苷酸序列与其他分离物的相似性在89.2%～90.6%,其中与SPLCV美国分离物(HQ333135)的相似性最高,为90.6%;与日本分离物(AB433788)的相似性最低,为89.2%;与中国大陆分离物(FJ515896)CP基因的核苷酸序列相似性为90.2%。将SPLCV CP基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组质粒,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE分析得到了大小约为54.3kD的融合蛋白条带,说明CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

水稻条纹病毒外壳蛋白基因和病害特异性蛋白基因的克隆和序列分析

水稻条纹病毒编码的外壳蛋白 (CP)和病害特异性蛋白 (SP)是两种与症状密切相关的蛋白 .本文对我国云南 YL分离物的 CP基因和 SP基因进行了克隆和测序 .结果表明 ,CP基因和 SP基因分别由 96 6和 534个核苷酸组成 .与已发表的一些分离物相比 ,YL分离物 CP基因与我国山东 C分离物和日本 T、M分离物的核苷酸序列一致性在 96 .0 %左右 ,氨基酸序列一致性为 97.0 % ,但从序列一致性和碱基变异方式来看 ,C分离物与 T、M分离物的亲缘关系稍近 .YL 分离物 SP基因和云南 CX分离物之间有 99.0 %的核苷酸序列一致性 ,但与 T、M分离物的核苷酸一致性只有 94 .0 %左右 .可见 ,不同分离物间 SP基因的变异与其地理分布有密切的关系 .     

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。     

黄瓜花叶病毒亚组研究进展

综述了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组研究的进展．根据寄主反应、血清学关系、病毒外壳蛋白肽链图谱分析、ｄｓＲＮＡ分析、核酸杂交、ＲＴ－ＰＣＲ产物酶解分析及核酸序列分析等方法,可将现有ＣＭＶ株系或分离物区分成２个亚组,尤其是利用单克隆抗体、核酸杂交、ＰＣＲ及核酸序列分析,能准确地将不同亚组的分离物区分开．从已知序列的ＣＭＶ株系分析,不同亚组株系的核苷酸序列同源率各ＲＮＡ组分仅为５８％～７５％,同亚组株系的核苷酸序列同源率则达８６％～１００％．将ＣＭＶ株系或分离物区分成２个亚组反映了它们之间的进化关系．文章最后就我国ＣＭＶ亚组的研究提出看法和建议