从腹泻的马驹粪便中分离的冠状病毒的特征

冠状病毒科都是RNA病毒,感染多种禽类和哺乳动物。分为冠状病毒属和环曲病毒属,这两个属在形态学、基因组和基因表达上有相似性。冠状病毒属具有感染性单股RNA分子,长度为20～30kb。病毒有囊膜,呈多形性,直径为80～220nm,囊膜上有棒状突起,长约20nm。其已知的三种主要的结构蛋白:S糖蛋白90～180kDa,M蛋白20～35kDa,N蛋白50～60kDa,除此之外,一些冠状病毒还包括第四种主要结构蛋白,即血凝素-酯酶(HE)蛋白120～140kDa。根据冠状病毒抗原性的不同,通过血清学分析及核苷酸序列分析,冠状病毒分为三个主要的抗原组。人的冠状病毒(HCV)229E…     

猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定

从广州某猪场采集疑为病毒性腹泻的病猪粪便，除菌处理后接种PK—15传代细胞，采用在接种物和细胞维持波中加入60μg/mL胰蛋白酶的方法，分离到一株野毒。中和试验、动物回归试验和电镜观察结果表明，分离的病毒为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

猪流行性腹泻病毒SZ株的分离与鉴定

从资阳某猪场发生腹泻症状的猪肠道内容物中分离得到一株病毒,经荧光检测、RT-PCR检测及序列分析鉴定后,证实该分离株为猪流行性腹泻病毒,命名为SZ株。PCR方法克隆S基因的部分片段,序列分析结果表明PCR扩增的部分S基因与其他毒株比对,结果表明与CH/XJUrumqi及韩国AF500215 S1的亲缘关系较近。     

山东潍坊地区犬冠状病毒的分离鉴定

收集2009年10月—2010年2月共4个月山东潍坊地区犬粪便样品42份,其中家庭单养犬的腹泻粪便样品20份,潍坊地区某养犬基地犬的健康犬粪便22份。对粪便进行常规处理后,用犬肾传代细胞系(MDCK)分离病毒,共得到3株病毒,分别命名为CCV-WF1,CCV-WF2,CCV-WF3。经电镜观察、病毒理化特性、动物回归试验及RT-PCR检测证明为犬冠状病毒(CCV)。血清交叉中和试验表明,3株病毒之间存在一定的抗原交叉性。     

河南省牛病毒性腹泻病毒地方株的分离及鉴定

从河南省不同地区规模化肉牛场牛病毒性腹泻(BVD)疑似病例中采集病料,将处理好的6份病料接种MDBK细胞,并盲传4代,得到了两株可产生细胞病变的病毒,经测定该两株病毒的TCID50分别为10-6.59/0.1ml和10-6.51/0.1ml;琼脂扩散试验表明该两株病毒均能与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)OregonC24标准阳性血清反应,出现沉淀线,且均能被BVDV标准阳性血清中和;电镜观察到圆形、有囊膜、直径为40～60nm、囊膜表面有突起的病毒粒子,与BVDV颗粒基本一致。动物回归试验表明,用两株分离毒攻毒的2头3月龄犊牛均出现了和BVD自然病例相似的临床症状,并检测其抗原和抗体,结果均为阳性,从而确定分离的两株病毒均为BVDV,分别将其命名为HN-1和HN-2株。     

五株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及序列分析

为研究猪流行性腹泻病毒的流行情况并分析该病毒的培养特性,对甘肃、北京、河北、山西、浙江五个猪场送检的疑似猪流行性腹泻病猪小肠内容物,用RT-PCR方法进行检测,证明为猪流行性腹泻病毒核酸阳性。然后将阳性病料进行传代培养、病毒含量测定以及特异性检验,证明获得五株猪流行性腹泻病毒,分别命名为Ningxia9、Beijing5、Gaocheng8、Shanxi1、Zhejiang08。对分离的毒株进行S基因全长测序及氨基酸序列分析。结果表明:五株分离毒株在盲传19代开始出现明显的细胞病变,盲传到24代,出现稳定的细胞病变且五株分离毒株的24代病毒含量在104.5~5.0TCID50/m L之间;用S蛋白进行进化树分析表明,五株分离毒株与近年来国内流行毒株亲缘关系很近,在同一个进化分支上;分离的五株野毒株之间的氨基酸同源性高达99.2%~99.9%,而这五株野毒与Gen Bank上提交的2011年、2012年分离的野毒株的之间的氨基酸同源性为98.4%~99.9%;实验室分离毒株及国内近年流行毒株均与国内外经典毒株存在一定的共性,即特定位置氨基酸的插入、缺失或置换。     

猪丁型冠状病毒的分离鉴定与基因分析

对山东省某养殖场的腹泻病料进行检测,确认为猪丁型冠状病毒(PDCoV)阳性。使用ST细胞分离到一株PDCoV,命名为SD株。全基因序列测定以及与GenBank中其他68株PDCoV全基因序列比对分析以及遗传进化分析结果表明:PDCoV SD株的全基因组(不包括3'poly(A)尾)序列长度为25414个核苷酸(nt),与参考株HKU15-155、CH/Sichuan/S27/2012和CH-HB-2014的核苷酸同源性分别为98.97%、99.06%和99.13%;此外,在nsp2区的1739~1744位(对应于HKU15-44序列)中的6 nt(TTTGAA)缺失和nsp3区的2810~2818位的9 nt(TCGGCAATG)缺失为特征性基因突变;69株PDCoV呈现出明显的地域特征,其中美国与韩国的PDCoV毒株为一个大分支,越南与泰国PDCoV毒株为另一个小分支,中国的23株PDCoV则呈现出4个小分支,充分展现了该病毒的基因多样性。试验可为中国PDCoV的流行病学和诊断研究以及进一步的疫苗开发提供参考。     

从腺胃肿大病鸡中分离到一株冠状病毒

1998年秋 ,天津市郊区部分鸡场已作新城疫、呼吸型传染性支气管炎、肾病变型传染性支气管炎疫苗免疫的 1～ 2月龄雏鸡发生气喘、拉稀、极度消瘦、生长迟滞等症 ,临诊观察有传染性 ,死亡率约 30 %。鸡主送来病死鸡 ,要求诊断。我们从病料中分离到 1株能使鸡胚发育迟滞 ,胚体蜷曲     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒（PEDV）青海株（PEDV-QH）的M基因。经序列分析，PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框（ORF）全长为681bp，包含154A（22．61％），160G23．49％），217T（31．86％），150C（22．03％），编码226aa，分子质量约为25ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1／87、JS2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98．5％、98．4％、98．4％、98．2％和97．9％，推导的氨基酸序列同源性分别为99．1％、99．19／6、98．7％、98．2％、97．8％；M基因推导的氨基酸序列分析显示，M蛋白3次跨膜，有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点，3个潜在的N糖基化位点，4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1／87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示，PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

猪流行性腹泻病毒HeN21株的分离鉴定及致病性研究

为了解河南地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行及变异情况,本研究从该地区某疑似感染PEDV的发病猪场采集粪便样品,经RT-PCR检测并测序,结果显示该猪场为PEDV感染。将阳性样品接种Vero细胞进行病毒分离,并通过RT-PCR扩增、测序及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果显示分离到一株PEDV,命名为HeN21株。经PCR分段扩增病毒全基因组,测序、拼接后的结果显示,该病毒基因组全长28 036 bp。为进一步分析HeN21株的遗传演化特征,利用MegAlign分析HeN21株全基因组与GenBank中5株PEDV参考株全基因组序列的相似性;采用MEGA 11软件中NJ法构建HeN21株与Gen Bank中31株PEDV参考株S基因的系统发育树;采用MegAlign分析HeN21株S蛋白氨基酸序列的变异特征;进一步评价HeN21株对哺乳仔猪的致病性。相似性分析结果显示,HeN21株与PEDV参考株的相似性为96.6%～98.9%,其中与经典GIa亚型代表株CV777的相似性最低为96.6%,与GIIa亚型代表株AH2012和GIIb亚型代表株AJ1102的相似性均为98.5%。进...     

猪流行性腹泻病毒(XJ-DB2)株的分离鉴定

从新疆佃坝地区某猪场疑似流行性腹泻病毒(PEDV)感染的仔猪中采集肛拭子样品,将其接种到Vero细胞中,连续传代培养,并逐日观察细胞病变(CPE),分离得到一株PEDV病毒,命名为新疆佃坝2株(XJ-DB2)。将分离的XJ-DB2株进行ORF3基因序列分析比对和遗传进化分析,结果表明,XJ-DB2株为PEDV强毒株。其ORF3基因和我国分离的强毒株CHS株、CHGS株,韩国分离的强毒株处在同一个分支上,而目前广泛使用的疫苗毒株CV777、韩国分离的弱毒株、我国分离的弱毒株CHJS07则处在相对独立的分支上。XJ-DB2与CHS基因的核苷酸同源性最高为99.0%,与韩国分离的强毒株S-DR13同源性为98.8%,而与疫苗株CV777核苷酸同源性为97.3%。     

从进口种用奶牛中分离传染性牛鼻气管炎病毒

在对2865头进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBR中和抗体阳性奶牛中分离1株病毒。该分离株表现类似于IBR病毒特征的细胞病变(CPE),细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞,有时会发现有几个细胞核的巨大细胞。用特异性抗IBRV阳性血清与之进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为26.5,与对IBR标准株的中和抗体滴度相差不到一个滴度。调取IBRVLA株gB基因序列,设计出1对IBR特异性的引物进行PCR,能扩增出与目的基因片段大小一致的特异性条带。结果表明:分离到的病毒为IBRV。     

猪流行性腹泻病毒陕西HZ株的分离与鉴定

从陕西省某养猪场送检的腹泻仔猪小肠内容物中分离到1株病毒,用Vero细胞盲传至8代以后出现较为稳定的CPE,经理化特性检测、TCID50测定、RT-PCR鉴定及序列比对,最终确定该分离毒株为流行性腹泻病毒(PEDV),将其命名为PEDV HZ株。以分离株RNA为模板,经RT-PCR扩增出大小为681bp和1 326bp的M基因和N基因,并与其他国内外分离株的相应基因进行比较,结果显示,PEDV HZ株与其他国内外分离株的M基因和N基因核苷酸序列的同源性分别为98.1%~100%和93.9%~100%,氨基酸序列的同源性分别为96.9%~99.6%和93.0%~100%,遗传进化树分析显示,PEDV HZ株与中国株CHGD-01处于同一个进化分支,亲缘关系最近。     

牛病毒性腹泻病毒JN株的分离鉴定及E2基因的序列分析

本研究从疑似牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染牛的分泌物与排泄物中分离鉴定1株牛病毒性腹泻病毒,并进行E2基因序列分析。结果表明,分离株病毒命名为JN株;Reed-Muench法测定分离株病毒TCID₅₀为10^-7.5/0.1 mL;病毒中和试验结果表明,BVDV JN分离株可被BVDV阳性血清特异性中和,而不能被BVDV阴性血清中和;分离株病毒E2基因序列测序结果表明,该分离毒株属于BVDVⅠa亚型。     

两株新城疫病毒山东分离株的克隆及遗传变异分析

本试验根据已发表的新城疫病毒（NDV）的F基因序列设计特异性引物，对山东地区两株NDV流行株的F基因进行了克隆与序列分析，分别扩增到了A株和B株F蛋白编码区全基因，ORF全长均为1662bp。应用分子生物学软件对A株和B株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析。两毒株核苷酸序列同源率为87％，都编码553个氨基酸，氨基酸同源率为91％。与部分已发表的毒株相比：A株与－株同源率最高，为98％，B株与JS鹅株同源率最高，为98％。分离株都具有3个强疏水区。A株、B株裂解区氨基酸序列符合强毒株特点，二者均为强毒株。从基因分型情况看，A株属于基因Ⅸ，B株属于基因Ⅶ。A株与F48E9株遗传距离最近，B株与JS鹅株遗传距离最近。     

猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

为了了解四川地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生物学特征及基因的遗传进化关系,从四川某地采集了发病仔猪小肠,病料处理后在Vero细胞上进行盲传,通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）验证,成功分离出1株猪流行性腹泻病毒,命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S1序列与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%,与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。试验成功地从四川省分离鉴定得到1株猪流行性腹泻病毒,为该地区PEDV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。     

犬冠状病毒的分离鉴定及其纤突蛋白基因的克隆与序列比较

以犬胎原代细胞，采用同步接种、带毒传代和添加新细胞的方法，从１例腹泻犬脾脏和１例临床健康犬肠内容物中分离出２株犬冠状病毒（ＣＣＶＹＳ１，ＣＣＶ ＣＩ１）。该２株病毒可使ＣＲＦＫ细胞出现典型的细胞融合病变，与从美国引进的ＣＣＶＮＬ－１８参考株形成的细胞病变相似；电镜负染和超薄切片观察，分离毒株细胞培养物中均含有典型的冠状病毒粒子，并形成胞浆内包涵体；经理化学、生物学鉴定，濉有ＣＣＶ的特性；间接免疫荧     

1株猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

从BVDV阳性仔猪病料中分离病毒,为开展猪源BVDV病原学研究奠定基础。将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV,命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5′-UTR与Npro PCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5′-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5 TCID50.0.2 mL-1。SD0803 5′-UTR、Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与已知BVDV-1各亚型之间同源性较低,单独成一分支。结果表明,成功分离鉴定1株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。     

6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便（2013—2017年）;对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析。结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1 326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62。核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%。其中,5株PEDV分离株（N12、N22、N32、N52和N62）与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株（LZC、CHS）的同源性较低（94.1%~96.3%）,亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性（96.9%~99.2%）,亲缘关系较近;而N42正好相反。该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主。