切割取样后胚胎的冷冻保存技术的研究

研究了切割取样后小鼠胚胎和牛胚胎冷冻-解冻的技术方法。结果表明：（1）分别以10％甘油、10％乙二醇作为冷冻液以及在以上两种冷冻液中分别添加10％葡聚糖＋0．1mol／L蔗糖作为冷冻液常规方法冷冻切割后的小鼠胚胎，冷冻-解冻后体外培养72h总发育率分别为56．9％（259／455）、81．8％（604／738）、84．8％（540／637）和59．5％（308／518）。（2）取样后胚胎体外短暂培养（0-4h）并不能提高切割取样后小鼠胚胎冷冻-解冻体外培养发育率。（3）切割取样小鼠胚胎在25％甘油＋0．25mol／L蔗糖＋20％的血清为冷冻液，在-100～-110℃左右熏蒸2min快速冷冻后体外培养发育率为73．3％（33／45），切割取样牛胚胎快速冷冻-解冻移植妊娠率为57．1％（4／7）。     

牛性别鉴定胚胎切割取样技巧

本文根据牛胚胎不同发育时期及形态特征来选择切取部位并徒手进行切割取样。其取样方法对于开展牛胚胎性别鉴定技术具有实用性。     

两种蔗糖浓度对切割取样鼠胚冷冻解冻效果的研究

小鼠晚期桑椹胚、早期囊胚和扩大囊胚，经切割取样分别采用０．３６５Ｍ和０．２５Ｍ蔗糖浓度进一步细管和分步脱除甘油解冻后体外培养发育率分别为６５．５％、４６．４％和７５．４％，两种浓度间差异显著（Ｐ＜０．０５）；分步脱除甘油解冻瑟前者差异不显著（Ｐ＞０．０５），与后者差异极显著（Ｐ＜０．０１）。     

徒手切割哺乳动物胚胎方法学研究

试验共采集昆白系小鼠新鲜胚胎２８０枚，均为晚期桑椹胚和早期整胚，分为３组：Ａ组采用Ｎｉｋｏｎ相差倒置显微镜及右侧显微操作系统用玻璃针切割，发割前用０．５％￣０．８％，链霉蛋白酶／ＰＢＳ液软化透明带。Ｂ组用相同仪器切割，不做软化处理。Ｃ组胚胎软化处理后放入硅化的载玻片上的ＰＢＳ液滴中，在立体显微针上，手持显微手术刀（或玻璃微针）进行切割。共解冻１０８枚小鼠冻胚，对应与鲜胚进行同样的分组：Ａ’组，Ｂ‘     

小鼠卵母细胞透明带的切割

透明带的切割是哺乳动物早期胚胎显微操作技术中的一个重要环节，本文以小鼠为例介绍一种新的透明带切割方法。     

热应激对植入前牛胚胎发育的影响

采集屠宰母牛卵巢和输卵管中的卵母细胞，进行体外受精，受精卵继续在体外培养。将发育3d的牛胚胎于42℃下分别培养0．5、2．0和4．0h，与对照组（39℃）牛胚胎相比，接触最高热应激（42℃，4h）处理的胚胎，约509／6的胚胎发育速度明显下降。而处理组牛胚胎发育到第9d的囊胚数、细胞数及内细胞团与滋养外胚层比率与对照组差异不显著（P〉0．05）。表明，温度升高对牛囊胚期胚胎的发育没有明显损害。对9d的囊胚进行基因性别分析发现，正常体外培养的雄胚发育快于雌胚，而在发育第3d受42℃热应激后，到囊胚期生存的胚胎性别比率发生改变，雌胚比率高于雄胚，表明雌性胚胎比雄性胚胎具有更强的抗热应激能力。     

共培养消除次黄嘌呤对胚胎发育的抑制作用

将昆明小鼠原核胚分别与不同贴壁程度的山羊原代输卵管上皮细胞（oviductal epithelial cells，OECs）共培养，确定体细胞的贴壁程度对共培养胚胎发育的影响。然后，采用高压液相色谱仪（HPLC）测定培养液中次黄嘌呤（hypoxanthine，HX）浓度，确定不同贴壁程度体细胞降解HX的能力。结果表明：与山羊原代0ECs共培养，能很好地促进小鼠胚胎发育，发育到囊胚的比例约为60％，其中贴满1d组的胚胎发育效果最好。在此基础上，检测培养液中HX浓度，发现贴满1d组培养液中HX浓度显著低于贴满3d和5d组（P〈0．05），表明体细胞降解HX的能力随培养时间的延长而下降。     

牛体外受精的精子获能方法对受精率和胚胎发育的影响

从屠宰场获得牛卵巢,采取卵母细胞,成熟培养用ＴＣＭ１９９＋犊牛血清;精子获能处理,以ＢＯ液＋肝素钠为基础,三个试验组分别添加咖啡因、蔡碱和已酮可可碱,受精经分别为８１．３％、８３．３％、８８．９％,均显著高于对照组（Ｐ〈０．０１）,三个试验组的囊胚率分别为２０．４％、１９．３％、２１．２％。试验得出以下结论：囊胚率与受经成正比,添加已酮可要碱效果最好。另外组内种公牛成绩也有差异。     

牛几种卵母细胞数和精子浓度对体外受精及早期胚胎发育的影响

在容量为46μl的受精液滴中,(一)滴内精子浓度固定为1.2～1.7×100/ml,每滴分别加入1、10、25、50枚体外培养成熟的卵母细胞;(二)每滴内放入10枚成熟卵母细胞,加入不同量的精子,使滴内精于浓度分别为0.64×10~6/ml、1.6×10~5/ml、3.2×10~6/ml和4.8×10~6/ml。卵母细胞的体外成熟及体外受精均按Lu等报导的方法进行。试验结果表明,当受精液滴内精子浓度为1.2～1.7×10~6/ml,活率达0.45时,每滴加50枚卵母细胞进行受精,对分裂率和胚胎发育率均无显著影响(P>0.05)。受精滴内含10枚卵母细胞,加入活率为0.45的精子,较合适的精子浓度为0.64×10~6/ml～1.6×10~6/ml。精于浓度高于1.6×10~6/ml时,对分裂率虽无影响,但对分裂球进一步发育至囊胚有一定的影响。     

不同培养体系对牛体外受精早期胚胎发育的影响

为探讨体外受精早期胚胎的最佳体外培养体系,将从屠宰牛卵巢上获取的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精后获取的早期胚胎,分别用TCM199和mSOFaa与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养。结果表明：TCM199和mSOFaa均能使体外受精胚胎突破8～16细胞期的发育阻断,但是囊胚发育率仅为14.3%和15.5%,差异不显著;胚胎与牛卵泡颗粒细胞和牛输卵管上皮细胞进行共培养能够使胚胎的囊胚发育率达到30.2%和33.5%,差异不显著。     

活性氧对哺乳动物早期胚胎发育的影响

活性氧(ROS)是自然界普遍存在的含氧化合物的总称,它对哺乳动物早期胚胎发育具有不良影响。本文综述了活性氧对哺乳动物早期胚胎发育的影响以及它与胚胎体外发育阻滞的内在联系,对深入探讨哺乳动物早期胚胎体外发育阻滞的机理具有一定的意义。     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

类固醇激素对牛输卵管上皮细胞分泌的调节及其分泌物对小鼠胚胎发育的影响

模拟发情期（０～６ｄ）母牛外周血浆雌激素和孕酮变化水平，在添加相应水平１７β－雌二醇和孕酮的ＴＣＭ－１９９液中，培养间情期牛输卵管上皮细胞（ＢＯＥＣ）。５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＢＯＥＣ分泌物，发现上皮细胞受类固醇激素作用分泌的２类蛋白质分子量与自然发情期（０～６ｄ）分泌的特异蛋白相似。证明类固醇激素可以调节和启动间情期ＢＯＥＣ的分泌活动。当雌二醇浓度高达１ｍｇ／Ｌ时，即使不加孕酮，ＢＯＥＣ仍能分泌这２类蛋白质。在培养小鼠原核胚的ＣＺＢ培养液内添加牛输卵管上皮细胞分泌蛋白（ＢＯＥＰ），与添加间情期牛输卵管冲洗蛋白（ＢＯＰ）和小牛输卵管冲洗蛋白（ＣＯＰ）相比，能显著提高通过２－细胞阶段胚胎的百分率和桑囊形成率，表明ＢＯＥＰ能较好地促进胚胎的分裂和发育。但ＢＯＥＰ组的桑囊形成率显著低于对照组，表明ＢＯＥＰ中可能缺少某些低于Ｍｒ１．０×１０４的蛋白因子的协调作用，以及含有Ｍｒ３．０×１０４～５．６×１０４的分泌蛋白的抑制作用而阻碍胚胎分裂与发育。     

乙醇激活诱导小鼠孤雌胚的发育与核型分析

注射ｈＣＧ１８～１９ ｈ 后收集的小鼠卵母细胞, ８５ ％ 以上可为乙醇所激活, 产生均质单倍体、嵌合单倍体、１ 个原核的杂合二倍体和２ 个原核的杂合二倍体４ 种激活类型, 且它们的比率分别为８１－４ ％ 、１０－５ ％ 、４－６ ％ 和３－５ ％ 。单倍体胚胎体外培养后有少数可发育至囊胚期。单倍体孤雌胚在８ 细胞期开始出现二倍体核型, 从而形成单倍体胚胎、单倍体 二倍体嵌合胚和二倍体胚胎。孤雌胚的核型中还出现较高比率的非整倍体。     

牛胚胎玻璃化超快速冷冻一步法移植试验

应用 30 %乙二醇 0 .3mol/ L 蔗糖 - m- PBS液 (VS1)、30 %乙二醇 0 .3m ol/ L 蔗糖 5 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m-PBS液 (VS2 )、30 %乙二醇 0 .3mol/ L蔗糖 10 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m- PBS液 (VS3)玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎 ,一步法移植。结果显示 ,VS1、VS2、VS3组玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率分别为 10 0 % (2 0 / 2 0 )、95 %(19/ 2 0 )和 5 5 .6 % (5 / 9) ;培养存活率分别为 70 % (14 / 2 0 )、75 % (15 / 2 0 )和 2 2 .2 % (2 / 9) ;囊胚孵化率分别为 0、2 0 % (4/2 0 )和 0。VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率极显著地高于 VS3组 (P<0 .0 1) ;VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的培养存活率分别显著 (P<0 .0 5 )和极显著 (P<0 .0 1)地高于 VS3组。 VS1组冷冻的胚胎经一步法移植了 5头 (1枚 /头 ) ,未获得妊娠 (0 / 5 ) ;VS2组冷冻的胚胎用一步法移植了 10头 (1枚 /头 ) ,结果获得 2头妊娠(2 / 10 ) ,并产下 2头正常犊牛。     

Development to Term of Fused and Partially Enucleated Mouse Two-Cell Embryos

Contents: After the blastomeres of mouse two-cell embryos were fused by electric pulses within the zona pellucida, one nucleus of the fusion products was removed following the enucleation method described by McGrath and Solter (1983a, 1983b). 38% (196/520) of the fused embryos were enucleated successfully when Whitten's medium was used as enucleation medium and 434 of 1007 (43%) of the embryos when M 2 was used. 30% (47/159) of the partially enucleated embryos cleaved during their in vitro cultivation but only 3% developed to the morula or blasto cyst stage. 20 young (17%) were born after the transfer of 120 fused and partially enucleated two-cell embryos to 8 pseudopregnant recipients. It was shown that fused and partially enucleated two-cell embryos are able to survive and are able to reach adulthood, although their developmental rate is significantly lower than that of control embryos .
Here we report experiments for the examination of the developmental capacity of two-cell mouse embryos partially enucleated after fusion .     

不同发育阶段小鼠胚胎S、M—期卵裂球的检测以及低温对胚胎细胞DNA合成的影响

利用放射自显影技术检测了小鼠着床前胚胎(4-细胞、8-细胞、桑葚胚和囊胚)不同发育阶段(早、中、晚)S期和M期卵裂球的比率，并研究了低温(4℃)对小鼠胚胎发育及DNA合成的影响。结果显示，早期和中期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较高，分别是75%、92%，没有M期卵裂球，晚期4-细胞胚胎S期卵裂球比率较低(30%)，M期卵裂球比率为11%；早期和中期8-细胞胚胎S期卵裂球比率仍很高，分别是73%、80%，M期卵裂球分别为0、2.5%，晚期8-细胞胚胎S期卵裂球比率增至64%，M期卵裂球减少至9%；早、中、晚期桑葚胚的S期卵裂球比率分别是77%、72%和79%，M期卵裂球的比率分别是5%、3%和3%；早、中、晚期囊胚的S期卵裂球比率分别是78%、74%和77%，M期卵裂球的比率分别是4%、3%和4%。4℃的低温对小鼠早期胚胎的发育和DNA合成都没有明显影响；4-细胞、8-细胞胚胎和桑葚胚经低温处理及培养后其囊胚形成率和平均卵裂球数分别是62%和(26±6)个、54%和(25±7)个、87%和(34±8)个；4-细胞、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚经低温处理后S期卵裂球比率分别是97%、77%、70%和74%。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

3种中药有效成分对小鼠胚胎体外发育的影响

以mCZB添加抗生素为对照组,以分别添加0.1 mg/L小檗碱(berberine,BR)、0.5 mg/L川芎嗪(ligustrazine,Lig)和4 mg/L黄芩苷(baicalin,Bai)为试验组,比较各组胚胎孵化率、微滴中一氧化氮(Nitric oxide,NO)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及孵化胚胎的细胞数量,从而探讨中药有效成分对小鼠早期胚胎体外发育的影响。结果显示,Bai组(80.2%,81.3%)、Lig组(78.9%,77.6%)及BR组(76.7%,71.6%)胚胎孵化率极显著高于对照组(50.7%、47.8%)(P<0.01)。各组间NO含量,72 h较24 h均有减少,而120 h又均有增加且最高。各组间MDA含量,72 h和120 h与24 h比较呈现增加趋势,除Bai组120 h外,对照组均高于试验组。孵化胚胎细胞计数结果显示,BR组(87.2±8.6)、Lig组(83.9±7.7)和Bai组(81.9±6.2)与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P<0.01)。结果表明:3种中药有效成分均能促进小鼠早期胚胎的体外发育及胚胎细胞增殖,并对NO和MDA含量有一定影响。