山溪鲵皮肤β-microseminoprotein样蛋白的分离纯化及其cDNA克隆

从山溪鲵(Batrachuperus pachunii)皮肤匀浆液中经过Sephadex G-50凝胶过滤、AKTA(R)Resource Q阴离子柱和反向高压液相C4柱分离纯化得到相对分子质量为12 000的蛋白.利用其N端氨基酸序列设计引物,从山溪鲵皮肤的cDNA中克隆并筛选到该蛋白的cDNA序列.该cDNA序列的开放阅读框为339 bp,编码113个氨基酸残基组成的蛋白.在BLAST数据库搜寻比对分析表明,该蛋白的氨基酸序列与来自人类及其他哺乳动物β-microseminoprotein蛋白具有约40%的序列同源性.这也是首次在两栖类动物皮肤中确认β-microseminoprotein.初级结构分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白;多重序列比较显示,其氨基酸序列中的10个半胱氨酸位点及15个其他氨基酸位点与高等脊椎动物β-microseminoprotein中同种氨基酸有相同的位点.由此推测该蛋白属于β-microseminoprotein家族.     

山溪鲵皮肤系统的显微结构观察

用组织切片法和苏木精—伊红染色法对山溪鲵(Batrachuperus pinchonii)不同部位的皮肤进行了显微观察。结果表明,山溪鲵皮肤主要分为表皮和真皮,皮肤表面轻微角化,表皮下微血管丰富,利于皮肤呼吸;真皮中含有大量的皮肤腺,分为黏液腺和颗粒腺,黏液腺大多分布在头部和躯干部,尾部的颗粒腺多而大,尤其尾后侧更为丰富;不同部位皮肤厚度不同,躯干背部皮肤最薄,尾后侧皮肤最厚;色素细胞主要分布在疏松层近表皮处,在腹中部较少,而在其他部位较多。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT－PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV－PE）全长RNA3。经核苷酸序列测定，明确PE分离物RNA3全长2216nt，含有2个开放阅读框（ORDF），其中5'端的ORF（121－963nt)编码279aa的3a蛋白，3'端ORF（1260－1916nt)编码218aa的CP蛋白。5'端非编码区（NR）长120nt，基因间隔区（IP）长296nt，3'端NR区含301个碱.PE分离物编码的3a蛋白最明显的特征是在136－141位有一个独特的VWCLSS区域，将CMV－PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码 区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关。     

灰飞虱β3-微管蛋白cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱RNA，利用RT—PCR技术，克隆了灰飞虱体内β3-微管蛋白基因部分序列。进一步通过3’-和5’-RACE获得了全长。序列分析表明，该基因(LSTUB3)长1859bp，编码的蛋白含454个氨基酸，分子量约为51kDa；类似于其他昆虫的β-微管蛋白，LSTUB3含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF。另外，LSTUB3还具有1个由6个氨基酸组成的β3-微管蛋白特征性的插入序列：CASRGG。结合已发表的其他昆虫该基因的序列，构建了分子系统树，系统分析表明：LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性，达85．7％以上。     

鸡IL-1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 为模板,据已报道的８ 种哺乳动物 Ｉ Ｌ—１β核酸序列保守区设计合成１ 对引物,反转录合成ｃ Ｄ Ｎ Ａ 链,经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,回收扩增后的 Ｄ Ｎ Ａ 片段,用ｋｌｅｎｏｗ 酶处理,与 Ｐｕ ｃ１ ９ ／ Ｓｍ ａ Ｉ 连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌 Ｊ Ｍ１ ０ ９ ,筛选出含有插入片段的重组质粒,用 Ｐ Ｃ Ｒ 及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡 Ｉ Ｌ－ １β片段的ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆;再经序列分析测定,得知此片段长为２７０ｂｐ ,与人及小鼠 Ｉ Ｌ—１β基因核苷酸序列同源性分别为４５ ％ 和３０ ％ 。     

灰飞虱β3-微管蛋白 cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱 RNA,利用 RT- PCR技术,克隆了灰飞虱体内β 3-微管蛋白基因部分序列.进一步通过 3'- 和 5'- RACE获得了全长.序列分析表明,该基因 (LSTUB3) 长 1 859 bp,编码的蛋白含 454个氨基酸,分子量约为 51 kDa;类似于其他昆虫的β-微管蛋白, LSTUB3含有 2个氨基酸保守区 NNWAKGHY和 RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF.另外, LSTUB3还具有 1个由 6个氨基酸组成的β 3-微管蛋白特征性的插入序列 CASRGG.结合已发表的其他昆虫该基因的序列,构建了分子系统树,系统分析表明 LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性,达 85.7%以上.     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

鸡IL—1βcDNA片段的克隆及序列分析

本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７     

日本蟾蜍皮肤claudin-4 cDNA的克隆与序列分析

为研究日本蟾蜍Bufo japonicus formosus皮肤中多肽类有效成分,通过菌落聚合酶链式反应（PCR）对日本蟾蜍皮肤cDNA质粒文库进行筛选,克隆到2条claudin-4全长cDNA序列（GenBank登录号为JX481975和JX481976）,并对它们进行生物信息学分析。日本蟾蜍claudin-4的2条cDNA全长分别为1 707 bp和1 697 bp,开放阅读框均为630 bp,其中虽有5个碱基不同,但编码的209个氨基酸完全相同。两者的5端非翻译区域序列长度不同,前者为50 bp,后者为41 bp,3端非翻译区域则分别为1 027 bp和1 026 bp。氨基酸序列同源性分析显示,日本蟾蜍claudin-4与非洲爪蟾Xenopus laevis的同源性最高,为88％,与其他7种动物的同源性介于65%~72%。克隆到2条日本蟾蜍claudin-4基因的cDNA序列,为今后研究日本蟾蜍Claudin-4 生物学功能奠定了基础。图5参21     

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85 kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的hLYZ cDNA序列的同源性为99%。推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础。     

烟草WS38生长素结合蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RTPCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆了大口黑鲈（Micropterus salmoides）胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5′端非翻译区101 bp、3′端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明：推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%~94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%~62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。     

水牛垂体催乳素cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中报道的几种哺乳动物催乳素（PRL）基因序列，设计1对特异性引物。从广西本地水牛脑垂体中提取总RNA，利用RT—PCR技术扩增水牛PRLeDNA全序列，并连接到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序，测定结果表明：该eDNA开放阅读框（ORF），长度为690bp，编码氨基酸为229个，其中前19个氨基酸为信号肽。用NCBI上的Blast功能将测序结果同GenBank已发表的序列进行比对，具有很高的同源性，其中与牛属动物同源性最高，达98．4％，证明所克隆的序列为水牛PRLeDNA全序列，已提交到GenBank（登陆号：EF054878）。本研究成功克隆水牛PRLeDNA全序列，为下一步构建原核表达载体、表达体外蛋白，以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

大口黑鲈胰岛素基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

胰岛素在鱼体内是一种重要的内分泌激素,其主要的生理功能是调控鱼体的代谢和血糖稳定。用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)技术克隆了大口黑鲈(Micropterus salmoides)胰岛素基因cDNA全序列,并对其编码的氨基酸序列和蛋白结构进行了分析。结果显示,该基因cDNA序列全长665 bp,其中包括5'端非翻译区101 bp、3'端非翻译区213 bp和开放阅读框351 bp。该开放阅读框编码包括信号肽、B链、C肽和A链的116个氨基酸,其分子量约为12.7 ku,理论等电点为5.44。在线分析表明:推测的大口黑鲈前胰岛素原氨基酸序列存在一段跨膜区;并存在信号肽序列,信号肽分裂位点在Ala24-Phe25处。大口黑鲈与其他硬骨鱼类及脊椎动物的前胰岛素原氨基酸序列的比对结果显示,大口黑鲈前胰岛素原A链和B链氨基酸序列均高度保守,与其他硬骨鱼类的前胰岛素原氨基酸序列相似度较高,为75%～94%,但与其他脊椎动物的相似度较低,为59%～62%。用邻接法构建的系统进化树显示,大口黑鲈前胰岛素原与同为鲈形目的岩钝鲈、红甘鲹和尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。研究亮点:采用RT-PCR和RACE技术首次克隆了...     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β（IL-1β）全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831 bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期（4 h）白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移（12,24 h）并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。     

一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析

锌指蛋白 (ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ)是一类具有“手指状”结构域的转录因子 ,负责调控基因的表达。锌指蛋白主要通过与核酸的相互作用 ,显示出不同的功能 ,如促进转录、抑制转录、单链ＤＮＡ结合、ＲＮＡ结合或ＲＮＡ/ＤＮＡ双向结合[1 ] 等。Ｃｙｓ2 /Ｈｉｓ2型锌指 (也称ＴＦⅢＡ型 )是真核生物的转录因子中结构描述的最为清楚的转录因子 ,其锌指区为ＣＸ2 - 4 ＣＸ3ＦＸ5ＬＸ2 ＨＸ3- 5Ｈ的结构[2 ] 。植物中目前已经克隆了一些Ｃ2Ｈ2型锌指蛋白基因 ,其中很多锌指区具有ＱＡＬＧＧＨ的保守区 ,如与拟南芥花发育相关的ＳＵ …     

猕猴桃钙调蛋白cDNA的克隆及测序

以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序列合成５′端和３′端引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ｃＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列上与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源性，其编码的氨基酸与大麦和苜蓿的不同分别只是一个氨基酸的差异，同源率高达９９．３％．     

东北白鹅抑制素/活化素βB亚基成熟区cDNA的克隆

利用RT-PCR技术从东北白鹅卵泡的总RNA中扩增出了抑制素βB亚基成熟区序列,经RCR扩增出357bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化到JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定,并进行了测序分析,获得的克隆序列与设计的序列一致。