广东省辣椒疫霉菌对嘧菌酯的敏感性

从广东省各地采集了54个辣椒疫霉菌株,分别测定了菌丝生长和游动孢子囊形成对嘧菌酯的敏感性。结果表明,嘧菌酯对辣椒疫霉的菌丝生长具有很强的抑制作用,EC₅₀范围为0.1428～1.9509μg/mL,平均为0.9649μg/mL;对游动孢子囊形成的抑制作用更强,EC₅₀范围为0.0010～0.0844μg/mL平均为0.0239μg/mL。正态分析表明,辣椒疫病菌54个菌株菌丝生长对嘧菌酯的敏感性符合正态分布,而孢子萌发则在高浓度区具有拖尾现象,表明自然界中已存在个别具有一定耐药性的辣椒疫霉种群。     

番茄叶霉病菌对嘧菌酯的抗性检测及抗性风险评估

利用孢子萌发法测定了从河北、浙江、江苏、山东、四川等省田间采集的97个番茄叶霉病菌菌株对嘧菌酯的敏感性。结果表明,田间番茄叶霉病菌已对嘧菌酯产生不同程度的抗药性。97个菌株可分为敏感菌株(EC50值50值5.4~54 μg/mL),中抗菌株(EC50值54~270 μg/mL)、高抗菌株(EC50值270~1 350 μg/mL)、特高抗菌株(EC50值>1 350 μg/mL) 5种类型,分别占55.67%、14.43%、11.34%、10.31%和8.25%。其中从未用过甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的27个菌株的EC50平均值为(0.544±0.349) μg/mL,可作为敏感基残;高抗和特高抗菌株集中在常施用甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的河北定州。通过紫外线诱导和药剂驯化的方法获得了番茄叶霉病菌5个抗嘧菌酯突变体,其抗药性不稳定,在不含药PDA平板上继代培养后抗药性水平下降,甚至恢复至敏感状态;除突变体cf 21M1的产孢量高于其亲本外,抗药性突变体的菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率均显著低于其亲本菌株,所有抗嘧菌酯突变体及其亲本菌株接种于番茄离体叶片后,突变体病情指数与亲本菌株之间没有显著差异。嘧菌酯与多菌灵、苯醚甲环唑之间不存在交互抗药性。田间抗药性检测及室内抗药性风险评估结果表明,番茄叶霉病菌对嘧菌酯具有较高的抗药性风险。     

辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)不同发育阶段对嘧菌酯的敏感性研究

 细胞色素bc₁位点抑制剂包含作用于线粒体内膜外壁CoQ氧化位点抑制剂(Q_oIs)和作用于线粒体内膜内壁CoQ的还原位点抑制剂(Q_iIs)。从未使用过Q_oIs和Q_iIs的江苏省南京市和安徽省和县随机采集分离获得48个辣椒疫霉单游动孢子囊菌株,并测定了它们不同发育阶段对嘧菌酯的敏感性。结果表明,辣椒疫霉菌丝生长对嘧菌酯的敏感性最低,EC₅₀值范围在1.225~86.100 μg/mL,平均值为(21.041±14.397)μg/mL,其活性低于甲霜灵47.7倍;游动孢子囊形成和萌发对嘧菌酯的敏感性较高,EC₅₀值范围分别在0.006~0.996 μg/mL和0.053~0.334 μg/mL,平均值分别为(0.161±0.126)μg/mL和(0.155±0.023)μg/mL,其活性高于甲霜灵516.8倍;游动孢子萌发对嘧菌酯的敏感性最高,EC₅₀值范围在(0.018~0.111)μg/mL,平均值为(0.057±0.011)μg/mL,活性是甲霜灵的142.4倍。离体生物测定结果表明,水杨肟酸对嘧菌酯抑制菌丝生长的增效作用最强,对游动孢子囊形成的增效作用次之,而对游动孢子囊和游动孢子萌发过程的增效作用则不明显。     

烯酰吗啉与嘧菌酯对辣椒疫霉病菌生物活性的比较

为了分析烯酰吗啉与嘧菌酯对辣椒疫霉病原菌不同发育阶段的敏感性,分别采用离体和活体试验方法比较了供试药剂对病原菌的生物活性。结果表明,烯酰吗啉对辣椒疫霉菌菌丝生长、孢子囊产生以及游动孢子释放具有强烈的抑制作用,EC50分别为0.68、0.21和4.92μg/mL,其活性分别是嘧菌酯的34.7、30.4和4.6倍。烯酰吗啉与嘧菌酯在浓度为12.5μg/mL时对菌丝体细胞膜的电导率无影响,但当烯酰吗啉和嘧菌酯的浓度分别为25μg/mL和50μg/mL时其电导率值明显上升。采用液相氧电极法,测定了三种典型抑制剂与供试药剂对菌丝体呼吸代谢的影响,结果显示,嘧菌酯作用于三羧酸循环(TCA)途径,而烯酰吗啉对三羧酸循环(TCA)途径和磷酸戊糖(HMP)途径有一定的影响。室内盆栽试验结果表明:在相同浓度下,烯酰吗啉与嘧菌酯对辣椒疫病均具有较好的保护效果,两者无显著差异;在辣椒植株接菌后24h采用800μg/mL的药液喷雾处理时,烯酰吗啉对辣椒疫病的防治效果为66%,优于嘧菌酯。     

水杨肟酸对致病疫霉生长及其对嘧菌酯敏感性的影响

采用菌丝生长速率法测定了离体条件下水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的影响,同时测定了添加水杨肟酸对致病疫霉在不同生长阶段对嘧菌酯敏感性的影响。结果表明:水杨肟酸在低浓度时对致病疫霉菌丝生长有一定的促进作用,但随其浓度升高,对病原菌的抑制作用逐渐增强,10μg/m L时,水杨肟酸对致病疫霉菌丝生长的抑制率小于10%,50μg/m L时,其平均抑制率大于70%。与单用嘧菌酯的处理相比,嘧菌酯中添加10μg/m L的水杨肟酸时,致病疫霉对嘧菌酯的敏感性不受水杨肟酸的影响,其抑制菌丝生长的平均EC50值分别为0.08和0.10μg/m L,抑制孢子囊萌发的平均EC50值分别为0.65和0.67μg/m L;同时,添加10μg/m L的水杨肟酸对孢子囊产量、游动孢子释放以及休止孢萌发均无显著影响;但嘧菌酯中添加50μg/m L的水杨肟酸时,除对致病疫霉菌丝生长无显著影响外,对其他各生长阶段均有显著影响。因此,在离体条件下测定致病疫霉对嘧菌酯的敏感性时,可不必添加水杨肟酸。     

重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺的敏感性及抗性突变体的生物学性状

为明确重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺的抗性风险,采用菌丝生长速率法测定了采自重庆未使用过氟吡菌胺地区的110株辣椒疫霉菌株对氟吡菌胺的敏感性,并对辣椒疫霉抗氟吡菌胺突变体的诱导方法及抗性突变体的主要生物学性状进行了研究。结果表明:110株辣椒疫霉对氟吡菌胺的EC₅₀平均值为(0.32 ± 0.11) μg/mL,不同菌株的敏感性频率呈连续单峰曲线分布,未出现敏感性明显下降的亚群体,因此可将该EC₅₀平均值作为重庆地区辣椒疫霉对氟吡菌胺田间抗性监测的敏感基线。通过紫外诱导菌丝体的方法,共获得3株可稳定遗传的抗氟吡菌胺突变体,抗性倍数介于69.5~98.5之间,突变频率为0.86%;抗性突变体BS11-5-1与亲本菌株BS11-5在菌丝生长速率、温度适应性、产孢子囊能力及致病力方面均无显著差异,而抗性突变体JLP11-4-2和JLP11-4-3在菌丝生长速率、温度适应性、产孢子囊能力及致病力方面均显著低于亲本菌株JLP11-4;不同抗性突变体对渗透压的敏感性与亲本菌株之间均存在不同程度差异;3个抗性突变体对Biolog PM1中95种碳源的利用情况与亲本菌株基本相似。交互抗性测定表明,辣椒疫霉抗氟吡菌胺突变体对甲霜灵、霜脲氰、烯酰吗啉、丁吡吗啉及嘧菌酯之间均不存在交互抗性,建议可将氟吡菌胺与上述几种杀菌剂交替或混合使用。     

辣椒炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性测定

 从江苏和海南省随机采集分离获得45个辣椒炭疽病菌单孢菌株,根据孢子形态鉴定其病原菌为Colletotrichum gloeosporioides和C.capsici,其中C.gloeosporioides占总菌株数的64.4%.筛选出甘油琼脂(AEA)培养基和水琼脂(WA)培养基,分别作为产孢法和孢子萌发法测定辣椒炭疽病菌对嘧菌酯敏感性的适宜培养基.通过孢子萌发法测定2种病原菌45个菌株对嘧菌酯的敏感性范围在0.009~0.091μg/mL之间,平均EC₅₀为(0.047±0.040)μg/mL.其中29个C.gloeosporioides菌株和16个C.capsici菌株的平均EC₅₀值分别为(0.051±0.047)μg/mL和(0.041±0.024)μg/mL.研究发现旁路氧化酶抑制剂水杨肟酸(SHAM)对嘧菌酯抑制分生孢子萌发有协同增效作用,且嘧菌酯抑制辣椒炭疽病菌菌丝生长的能力较弱.     

嘧菌酯对番茄早疫病菌的抑制作用

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法分别测定了嘧菌酯对番茄早疫病菌Alternaria solani菌丝生长的抑制作用及其对分生孢子萌发的影响,同时测定了其对菌丝呼吸速率的影响。结果表明,嘧菌酯抑制番茄早疫病菌分生孢子萌发的作用强于对菌丝生长的抑制作用。抑制菌丝生长的剂量-反应曲线与抑制菌丝呼吸的剂量-反应曲线趋势相似,但菌丝在经嘧菌酯处理5~7 h后呼吸速率恢复到对照水平,相比之下,嘧菌酯却能一直抑制菌丝的生长。因此,采用孢子萌发法测定番茄早疫病菌对嘧菌酯的敏感性比用菌丝生长速率法测定更为适宜。水杨肟酸与嘧菌酯在抑制番茄早疫病菌菌丝生长和分生孢子萌发方面有协同作用,对菌丝生长的平均协同系数为7.24。随处理时间延长,药剂对菌丝耗氧的抑制作用下降,但仍抑制菌丝生长。研究表明:呼吸作用对药剂的敏感性随着处理的延长而下降的机理不是因为旁路氧化途径增强, 也不是因为基质中药剂效力的下降,而是存在其它机制。     

海南辣椒炭疽病病原菌鉴定及其对嘧菌酯的敏感性分析

2015年3月调查了海南省海口、琼海、万宁、儋州等市(县)的辣椒炭疽病的发生与病情,对采集的样本分离出的7株纯菌株进行了致病性测定及形态学观察,通过生长速率法及孢子萌发抑制法分别测定嘧菌酯对辣椒炭疽病病原菌菌丝和孢子的影响。结果表明,菌株DM4-2和DZ1-3为黑点炭疽菌(Colletotrichum capsici),菌株NP3-9、NP5-3、DZ2-7、HN5-11和HN2-6均为胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)。各菌株对嘧菌酯的敏感性显示,相对于菌丝,其病菌孢子对嘧菌酯的敏感性更高;相对于胶胞炭疽菌,黑点炭疽菌菌株DM4-2和DZ1-3对嘧菌酯更为敏感。     

柑橘黑点病菌种群对嘧菌酯敏感性基线的建立

为明确柑橘黑点病菌Diaporthe citri对嘧菌酯的敏感性以及嘧菌酯在我国柑橘黑点病防治中的应用潜力,分别采用菌丝生长抑制法和孢子萌发抑制法测定了来自浙江、湖南、江西、贵州4个主要柑橘产区的66个柑橘黑点病菌菌株对嘧菌酯的敏感性,并建立了其种群对嘧菌酯的敏感性基线。结果显示：嘧菌酯对柑橘黑点病菌菌丝生长和孢子萌发的EC₅₀平均值分别为(0.228 5±0.113 8)μg/mL和(0.025 6±0.006 9)μg/mL,种群对嘧菌酯的敏感性频次分布曲线为连续的单峰型,符合正态分布。因此可将嘧菌酯对这66个菌株的菌丝生长和孢子萌发的平均EC₅₀作为柑橘黑点病菌对嘧菌酯的敏感性基线,该敏感性基线可作为监测田间柑橘黑点病菌对嘧菌酯敏感性变化的参考,对指导今后科学用药具有现实意义。同时,本研究所使用的66个菌株对嘧菌酯敏感性均较高,没有抗性菌株出现,表明未来可以将嘧菌酯用于柑橘黑点病的防治,作为黑点病防治主打药剂代森锰锌的一种补充。     

江西省辣椒疫霉生理小种构成及其对烯酰吗啉的敏感性分析

为了明确江西省辣椒疫霉对烯酰吗啉的抗药性风险,采用灌根法鉴定了108个江西辣椒疫霉菌株的生理小种,并采用菌丝生长速率法测定了江西省辣椒疫霉对烯酰吗啉的敏感性.结果表明,菌株LP20、LP38和LP48属于生理小种3,占测定菌株总数的2.8％,其余菌株属于生理小种2,占测定菌株总数的97.2％,为优势生理小种,且未发现生理小种1.烯酰吗啉抑制辣椒疫霉菌丝生长的EC50值范围为0.1149～0.2868 μg/mL,最不敏感菌株的EC50值为最敏感菌株的2.49倍.不同地区的菌株对烯酰吗啉的敏感性差异不大,崇义的菌株平均EC50值最低,为0.1367 μg/mL,分布范围为0.1213 ～0.1462 μg/mL;吉水的菌株平均EC50值最高,为0.2185 μg/mL,分布范围为0.1805 ～0.2835 μg/mL.     

辣椒疫霉对双炔酰菌胺敏感性及对其它杀菌剂的交互抗性

采用菌丝生长速率法测定了不同地区115个辣椒疫霉菌株对双炔酰菌胺的敏感性,同时测定了紫外诱导和药剂驯化的10个抗性突变体及其4个亲本菌株对双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵、嘧菌酯和霜脲氰的敏感性。山东青州、寿光和河北定兴、藁城4地辣椒疫霉菌株均对双炔酰菌胺较敏感,且敏感性差异不显著。不同抗性水平菌株对5种药剂的敏感性测定和相关性分析结果显示,双炔酰菌胺与其它几类药剂之间均不存在交互抗性。10个抗性突变体继代培养11代后,8个抗性突变体抗药性不能稳定遗传;2个抗性突变体抗药性不仅能够稳定遗传,且EC₅₀值维持在很高水平,分别为1 429.524 μg/mL和6 872.476 μg/mL,因此,双炔酰菌胺的连续使用有利于抗药群体的发展。     

致病疫霉对缬菌胺抗性突变体生物学特性及抗性风险量化评估

 通过研究致病疫霉对缬菌胺抗性突变体的生物学特性,评估致病疫霉对缬菌胺产生抗性的风险。采用菌丝生长速率法检测田间菌株对缬菌胺的敏感性;通过比较抗性突变体在无药条件下继代培养前后对缬菌胺的敏感性来确定其抗性稳定性;采用离体叶片法测定抗性突变体及其亲本敏感菌株的适合度和竞争力;通过量化7个基本抗性因素的风险值评估致病疫霉对缬菌胺的基本抗性风险。结果表明:在2018年从内蒙、河北、贵州、四川、黑龙江等五省(自治区)采集分离的153个菌株和2019年从河北、内蒙采集分离的40个菌株中低抗菌株分别占31.4%和35.0%,敏感菌株分别占68.6%和65.0%,抗性指数均为0.34,抗性倍数分别为1.5和2.1,未发现中抗和高抗菌株;8个抗性突变体在无药条件下继代培养10代后,少数抗性突变体的抗药性不能稳定遗传;6个抗性突变体的适合度均显著低于其亲本敏感菌株;4个抗性突变体与其亲本菌株的孢子囊不同比率混合物分别在离体叶片上继代培养1、3、7代的抗性频率显著低于初始抗性频率或与初始抗性频率无显著差异;致病疫霉对缬菌胺7个基本抗性因素的风险值之和为9,推测致病疫霉对缬菌胺的基本抗性风险为低至中等。建议加强致病疫霉菌群体对缬菌胺的抗性监测,将缬菌胺与不同作用机理的杀菌剂交替或混合使用,以延缓抗药性产生和发展。     

致病疫霉对缬菌胺敏感基线的建立及抗性风险评估

为建立致病疫霉Phytophthora infestans (Mont.) de Bary对缬菌胺的敏感基线,采用菌丝生长速率法测定了从河北省、黑龙江省、内蒙古自治区、贵州省和四川省未使用过缬菌胺的地区采集分离的105个致病疫霉菌株对缬菌胺的敏感性;为明确致病疫霉对缬菌胺产生抗性突变体的难易程度,进行了紫外诱导和药剂驯化试验;为明确缬菌胺与常用药剂之间的交互抗性,测定了8个抗缬菌胺突变体及其6个亲本敏感菌株对6种常用杀菌剂的敏感性。结果表明:105株致病疫霉对缬菌胺的EC₅₀值范围为0.0594~0.159 mg/L,平均EC₅₀值为(0.102 ± 0.024) mg/L,不同敏感性菌株的频率呈连续单峰曲线分布,未发现敏感性下降的亚群体,因此可将缬菌胺对105株致病疫霉的平均EC₅₀值作为致病疫霉对缬菌胺的敏感基线;通过紫外诱变敏感菌株菌丝体获得了4个抗缬菌胺的突变体,其抗性水平介于 3.1~14.9倍之间,突变频率为0.54%,通过紫外照射敏感菌株孢子囊悬浮液获得了2个抗性水平分别为8.1倍和8.2倍的抗性突变体,突变频率为1.33 × 10?7;通过在含缬菌胺的黑麦蔗糖琼脂培养基上继代培养敏感菌株11代,获得2个抗性水平分别为3.1倍和9.4倍的抗性突变体。缬菌胺与烯酰吗啉和双炔酰菌胺存在交互抗性,与氟吡菌胺、嘧菌酯、甲霜灵和霜脲氰不存在交互抗性。初步推测致病疫霉对缬菌胺具有低到中等抗性风险,建议在生产上将缬菌胺与其他类型杀菌剂交替或混合使用,以延缓致病疫霉对缬菌胺抗性的产生。     

大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子在黑龙江省土壤中的越冬存活率

为探究大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子在黑龙江省土壤中的越冬存活率及其与所处土壤深度和媒介的相关性,以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,将培养基及病残体中的大豆疫霉卵孢子分别接种到试验田框栽土壤表层下不同深处,检测其卵孢子的越冬存活率,同时在框栽中定量播种不含任何已知抗疫霉根腐病基因的大豆品种Sloan(rps),苗期调查其发病率。结果表明,大豆疫霉卵孢子在黑龙江省土壤中的适生性较强,可在5~15 cm深度土壤中安全越冬,越冬存活率高达81.67%~96.33%。卵孢子越冬存活率与其所处的越冬媒介关系不大,而与土壤深度有关。在5~15 cm范围内,随着土壤深度的增加,卵孢子越冬存活率增加。处于深层土壤中的卵孢子更容易打破休眠,进入萌发前的萌动状态。各处理间卵孢子越冬存活率的显著性差异并未在发病率上表现出来,说明除了土壤深度外,还有其它因素影响发病率。     

浙江省果蔬灰霉病菌对嘧菌酯的抗药性研究

采用菌丝生长速率法,连续监测了2010—2012年间浙江省果蔬灰霉病菌对QoI类杀菌剂嘧菌酯的敏感性变化。 结果表明:病菌群体中的低敏感性亚群体的比例明显上升,EC50值>5 mg/L 菌株的比例分别为12.5%、15.8%和28.3%;在菌丝生长阶段和孢子萌发阶段,旁路氧化在灰霉病菌对嘧菌酯敏感性中的平均相对贡献值(F)分别为2.91±0.89和5.72±2.82;嘧菌酯抗药性菌株的菌丝生长速率、产孢量、产菌核数和致病力与敏感菌株相比无显著差异。抗药性分子机制研究表明,灰霉病菌中存在2种类型的cyt b基因:Ⅰ型cyt b基因在第143位密码子后紧跟内含子;Ⅱ型cyt b基因在第143位密码子后没有紧跟内含子。大多数的灰霉病菌菌株属于Ⅱ型。Ⅰ型菌株均为嘧菌酯敏感菌株,Ⅱ型菌株为嘧菌酯敏感菌株或抗性菌株。抗性菌株的cyt b 基因的第143位密码子由甘氨酸(GGC)突变为了丙氨酸(GCC),抗药性机制为G143A。     

马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗性的快速检测方法

为快速检测马铃薯晚疫病菌——致病疫霉Phytophthora infestans对甲霜灵的抗性,基于已知致病疫霉RPA190基因的T1145A变异引起的F382Y氨基酸点突变与甲霜灵抗性有关,通过设计4对特异性引物F382Y-F1/F382Y-R、F382Y-F2/F382Y-R、F382Y-F3/F382Y-R和F382Y-F4/F382Y-R建立等位基因特异性PCR(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR)快速分子检测法,其中F382Y-R引物在4对引物里保持不变,并分析所建分子检测法的特异性和灵敏度。结果表明,正向特异性引物F382Y-F2、F382Y-F3和F382Y-F4的3''末端在致病疫霉抗甲霜灵菌株原有核苷酸突变位点1145A(对应引物为F382Y-F1)的基础上,再人工引入第1144位的核苷酸突变,将1144T分别突变成1144G、1144C和1144A,并优化退火温度和特异性引物与内参引物ITS1/ITS4比例,最终确定最适退火温度分别为54、60和58℃,特异性引物与内参引物最适浓度比例均为5∶1。以该3条引物对应的3对特异性引物和内参引物ITS1/ITS4组成的3组多重AS-PCR引物对甲霜灵敏感和抗性菌株具有良好的特异性,敏感菌株的扩增产物含1条879bp的内参片段,抗性菌株的扩增产物为1条879bp的内参片段和1条461bp的目的片段。3组AS-PCR检测体系均具有较高的灵敏度,其中引物F382Y-F4/F382Y-R对致病疫霉DNA的检测灵敏度达0.4pg/μL,引物F382Y-F2/F382Y-R和F382YF3/F382Y-R的检测灵敏度达4pg/μL。