樱桃采后灰霉病菌对甲基硫菌灵、乙霉威和腐霉利的抗性

本文采用单孢分离法对四川汉源和山东烟台等地采集的樱桃果实进行了采后灰霉病的病原菌分离和鉴定;采用区分剂量法分别测定了菌株对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵、乙霉威和二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利的敏感性,并进一步分析了抗药性菌株的分子机制。结果表明,分离得到的54株樱桃采后灰霉病菌均为灰葡萄孢Botrytis cinerea,对甲基硫菌灵的总抗性频率高达79.6%,其中甲基硫菌灵抗性-乙霉威敏感(BEN R1)菌株频率为25.9%;甲基硫菌灵-乙霉威双重抗性菌株(BEN R2)频率为53.7%;检测到腐霉利抗性菌株(DCF R) 9株,频率为16.7%。甲基硫菌灵抗性菌株在β-tubulin基因上的突变共有2种类型：BEN R1抗性菌株中,第198位密码子发生点突变(GAG→GCG),编码氨基酸由Glu (E)突变成缬氨酸Ala (A);在BEN R2抗性菌株中,第198位密码子发生点突变(GAG→GTG),编码氨基酸由Glu (E)突变成缬氨酸Val (V)。DCF R菌株在BcOS1的第365位密码子由ATC突变成AAC或AGC,导致编码的氨基酸由异亮氨酸Ile (I)突变成天冬酰胺Asn (...     

番茄叶霉病菌对多菌灵、乙霉威及代森锰锌抗性检测

报道了番茄叶霉病菌Fulvia fulva对多菌灵、乙霉威及代森锰锌的敏感性基线,以及抗性频率和抗性水平。离体条件下,多菌灵、乙霉威及代森锰锌对番茄叶霉病菌敏感菌株的平均EC50值分别为0.101、2.475、9.067 μg/mL;最低抑制浓度(MIC)值分别为0.5、5、50 μg/mL 。山西晋南地区番茄叶霉病菌对3种杀菌剂的抗性频率最高,分别达到97.4%、70.5%、98.7%;山西吕梁地区与太原地区相对较低,但该病菌对3种杀菌剂的抗性频率也都超过了30%。辽宁沈阳、山东寿光、河北保定番茄叶霉病菌对多菌灵的抗性频率均为100%;对乙霉威的抗性频率前两地为100%,保定为10%;对代森锰锌的抗性频率都超过90%。所有抗性菌株对多菌灵均属于高抗类型,抗性指数超过5000,测不出MIC值;对乙霉威有50%的高抗菌株,抗性指数在100以上;对代森锰锌各地均未发现高抗菌株,低抗和中抗菌株所占比例较大,其抗性指数集中在50左右。对多菌灵与乙霉威具有双重抗性的菌株占测试菌株总数的49.9%,并且首次在田间发现了对3种杀菌剂都具有抗性的番茄叶霉病菌多抗菌株。     

甲基硫菌灵·乙霉威混配制剂的液相色谱分析

本文采用反相高效液相色谱外标法对6.5%甲基硫菌灵·乙霉威粉剂的有效成分进行定量测定,采用Nova-PakC18色谱柱,以甲醇:水(60:40)作为流动相,检测波长为254nm。该方法平均回收率分别为99.31%和98.91%,变异系数分别为0.32%和0.95%。     

葡萄白腐病菌对抑霉唑的敏感基线及其与不同杀菌剂的交互抗性

为明确山东省胶东地区葡萄白腐病菌Coniella diplodiella对抑霉唑的敏感性及抑霉唑与常规杀菌剂之间的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定葡萄白腐病菌对抑霉唑等杀菌剂的敏感性,并通过分析抑霉唑与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌毒力的相关性,判断抑霉唑与各药剂之间是否存在交互抗性。结果表明,供试69株葡萄白腐病菌菌株对抑霉唑的EC₅₀在0.13~55.53 μg/mL之间,最高值与最低值相差427.15倍;其频数分布图呈多峰曲线,第一主峰内EC₅₀平均值为6.34 μg/mL,可作为胶东地区葡萄白腐病菌对抑霉唑的敏感基线。与敏感基线相比,田间已出现抑霉唑低抗菌株,占检测总株数的8.70%,未检测到中、高抗菌株。选择3个抗性菌株连续继代培养10代后,其对抑霉唑的敏感性明显提高,说明其抗药性不能稳定遗传。抑霉唑EC₅₀对数值与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌的EC₅₀对数值之间的相关系数分别为0.799、-0.143、-0.089、-0.268和0.159,说明抑霉唑与戊唑醇存在一定的交互抗性,但与其他4种药剂之间不存在交互抗性。表明抑霉唑可用于胶东地区田间葡萄白腐病的有效防控。     

油菜菌核病菌对多菌灵和乙霉威的抗药性机理

生物测定结果表明,油菜菌核病菌田间菌株对多菌灵(MBC)敏感性表型呈多样性,即存在MBCS、MBCLRLR、MBCHRHR和MBCVHR表型.而对乙霉威(DIE)则只检测到DIES和DIEHR表型.MBCS、MBCLR和MBCHR菌株中除JD2-3菌株为DIES外,其余菌株均为DIEHR,MBCVHR菌株对DIE表现为DIES.MBC和DIE之间存在典型的负相关交互抗性.序列分析结果表明,表型为MBCVHRDIES菌株的β-微管蛋白基因,第198位氨基酸由Glu(GAG)突变为Ala(GCG);表型为MBCHRDIEHR菌株的β-微管蛋白基因的突变位点在第200位,由Phe(TTC)突变为Tyr(TAC);而表型为MBCSDIES和MBCLRDIEHR的菌株在所扩增的β-微管蛋白基因片段中未发生突变.初步表明,β-微管蛋白基因198和200位氨基酸的突变是引起油菜菌核病菌对多菌灵抗药性呈多样性的分子机理.     

葡萄霜霉菌对仿生杀菌剂缬霉威的敏感基线及其抗性突变体生物学性状的研究

 本文对葡萄霜霉菌对缬霉威的抗性风险评估进行了研究。采集尚未使用过缬霉威的105个葡萄霜霉菌株,建立其对缬霉威的敏感基线。葡萄霜霉菌对缬霉威的有效抑制中浓度EC₅₀为0.04～0.60 μg·mL^-1,其敏感性频率符合正态分布,表明这105株葡萄霜霉菌对缬霉威均表现敏感。取其中10株敏感菌的孢子囊经紫外线(UV)诱导,获得4个缬霉威抗性突变体,突变频率为6.8×10^-7。将这10株葡萄霜霉菌孢子囊在叶片上进行缬霉威药剂驯化处理获得7个抗性突变体。11个抗性突变体的EC₅₀值为4.37～14.11 μg·mL^-1,抗性水平17.4～71.6。在未用药处理的健康葡萄叶片上继代培养10代后,这11个抗性突变体抗性水平保持在17.1～71.0。其中药剂驯化获得的7个抗性突变体和1个紫外诱导获得的抗性突变体的抗性水平均表现稳定遗传。但是,其余3个紫外诱导获得的抗性突变体抗性水平明显下降。与各亲本菌株进行比较,11个抗性突变体的潜育期、侵染率、病斑扩展速度和产孢能力都有显著不同。其中2个药剂驯化获得的抗性突变体和3个紫外诱导获得的抗性突变体表现潜育期变长,2个药剂驯化抗性突变体和1个紫外诱导抗性突变体表现侵染率下降。表明在一些情况下,葡萄霜霉菌抗性突变体的潜伏期和侵染率会发生改变。药剂驯化获得的抗性突变体产孢能力存在显著差异,但与抗性突变与否无关。缬霉威与嘧菌酯、甲霜灵、烯酰吗啉和霜脲氰之间无交互抗药性。推测:葡萄霜霉菌对缬霉威为中到高等抗性风险,今后应定期对葡萄霜霉菌对缬霉威的抗性发生动态进行监测。     

梨黑星病菌对氟硅唑的敏感性及与不同杀菌剂之间的交互抗性

采用孢子芽管长度法,测定了采自河北省不同地区的88个梨黑星病菌 Venturia nashicola 菌株对氟硅唑的敏感性,并测定了10个相对敏感菌株和5个相对抗性菌株对甲基硫菌灵、醚菌酯、福美双和苯醚甲环唑的敏感性。结果表明:不同地区黑星病菌对氟硅唑的敏感性存在一定差异,平均EC50值为(1.3821±0.9276)μg/mL;氟硅唑对未使用过麦角甾醇生物合成抑制剂(EBI)类杀菌剂的75个梨黑星病菌菌株的平均EC50值为(1.1676±0.6128)μg/mL,最大值是最小值的16.91倍,其敏感性分布频率呈连续性单峰曲线,且符合正态分布,故可作为敏感基线用于监测田间梨黑星病菌对氟硅唑的敏感性变化。不同菌株对5种药剂的敏感性相互关系分析表明,氟硅唑和苯醚甲环唑之间呈显著正相关,但与醚菌酯、甲基硫菌灵和福美双之间均不存在交互抗性关系。     

白术黑斑病菌对甲基硫菌灵和腐霉利的抗性检测及对咪鲜胺敏感性基线的建立

黑斑病是影响白术种植的主要病害之一,2015—2017年从浙江省磐安、天台、新昌和嵊州4地采集、分离得到137株白术黑斑病菌Alternaria alternata,采用菌丝生长速率法检测其对甲基硫菌灵和腐霉利的抗性。结果表明:供试的黑斑病菌群体 (n = 137) 对甲基硫菌灵的高水平抗性频率为77.4%,中等水平抗性频率为22.6%,未检测到敏感菌株;对腐霉利的抗性频率为20.4%,含21株低水平抗性菌株和7株中等水平抗性菌株。7种杀菌剂的室内毒力测定结果表明:咪鲜胺对白术黑斑病菌的活性最高,EC₅₀值为0.15 mg/L。供试的137株白术黑斑病菌对咪鲜胺的EC₅₀值分布在0.05~0.87 mg/L之间,平均EC₅₀值为 (0.29 ± 0.11) mg/L,可作为敏感性基线。     

拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性及抗性菌株生物学性状和交互抗性

为评价玉米穗腐病主要致病菌拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides对多菌灵的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了采自山东、河北、河南、四川、甘肃、辽宁及宁夏7省(自治区)的168株玉米穗腐病拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性,并对经药剂驯化获得的拟轮枝镰孢抗多菌灵菌株主要生物学性状和交互抗性进行了研究。结果表明:多菌灵抑制拟轮枝镰孢菌丝生长的EC₅₀值在0.013 2~0.774 0 mg/L之间,平均EC₅₀值为(0.220 8 ± 0.143 7) mg/L。敏感性频率分布显示,供试病原菌群体中已出现对多菌灵敏感性下降的亚群体,但其中仍有35.71%的菌株对多菌灵的敏感性频率呈正态分布,因此可将此部分菌株的平均EC₅₀值 (0.081 4 ± 0.028 9) mg/L作为拟轮枝镰孢对多菌灵的相对敏感基线。药剂驯化共获得6株抗性菌株,抗性倍数在5.05~12.22之间。抗性菌株的菌丝生长速率及菌丝干重均低于亲本菌株,表明其抗性菌株的生物适合度有所降低,同时发现其抗药性均不能稳定遗传。室内交互抗性测定结果表明,拟轮枝镰孢对多菌灵的抗性与咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮及吡唑醚菌酯之间均不存在交互抗性关系。     

灰葡萄孢霉Botrytis cinerea对啶菌恶唑的敏感性和不同杀菌剂的交互抗性

为了明确灰霉病菌对新型杀菌剂啶菌恶唑的敏感性和该药剂与其它杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定河北省不同地区的95个灰霉菌菌株对啶菌恶唑的敏感性,并测定11个相对敏感菌株和3个相对抗性菌株对啶菌恶唑、嘧霉胺、速克灵、多菌灵和苯醚甲环唑的敏感性.结果表明,灰霉菌菌株间对啶菌恶唑的敏感性差异显著,EC50值在0.0693～3.0578μg/mL之间,平均为0.2045μg/mL,其中3个灰霉菌株Ec50值分别为平均EC50值的7.97、13.06和14.95倍;啶菌恶唑与上述不同作用机制杀菌剂之间的相关系数很低,不存在交互抗性.在无药PDA培养基上继代培养11代后,3个相对抗性菌株的敏感性明显提高,表明其抗药性不能稳定遗传.     

樱桃褐腐病菌对啶酰菌胺的敏感性及其对4种琥珀酸脱氢酶抑制剂的交互抗性

采用菌丝生长速率法测定了樱桃褐腐病菌Monilinia fructicola对啶酰菌胺的敏感性,同时研究了不同敏感性菌株的生物学性状,探究了琥珀酸脱氢酶B亚基的氨基酸突变与其对啶酰菌胺产生抗性的相关性,并分析了樱桃褐腐病菌对啶酰菌胺与其他3种琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHIs)氯苯醚酰胺、氟唑菌苯胺和氟吡菌酰胺之间的交互抗...     

不同寄主来源的Monilinia fructicola对多菌灵的敏感性及其遗传结构特征

美澳型核果链核盘菌Monilinia fructicola (G. Winter) Honey是引起多种果树褐腐病的重要病原菌,多菌灵是防治该病害的重要杀菌剂。为明确不同寄主来源的菌株对多菌灵的敏感性及遗传结构差异,研究测定了来源于樱桃、李子和毛桃的17株菌株对多菌灵的敏感性,同时基于Tub2核苷酸序列分析了来源于樱桃和毛桃的32株M. fructicola群体的遗传多样性和群体分化特征。结果表明:来自樱桃、李子和毛桃的17株菌株中,多菌灵的EC₅₀< 1 μg/mL和 > 1 μg/mL的菌株比例分别为58.8%和41.2%,其中EC₅₀> 50 μg/mL的菌株比例为17.6%。来自毛桃的菌株群体多样性比来自樱桃的高,其核苷酸多样性分别为3.25 × 10?3和0.94 × 10?3,单倍型多样性分别为0.883和0.242;两群体间存在显著的遗传分化,分化程度较高,其F_ST值达到0.148。单倍型网络分析结果显示:来自樱桃和毛桃的群体分别含有3种和9种单倍型,其中共有单倍型2种;不同单倍型在进化过程中主要发生了两个途径的进化,其中一个途径只出现了来自毛桃群体的1种单倍型,其他单倍型经过不同的突变步骤形成另一个途径。寄主特异性检验结果发现,来自樱桃的菌株具有一定的寄主特异性,而来自毛桃的菌株与寄主的关联性较差。综合研究表明,M. fructicola对多菌灵的抗性频率较高,且来自不同寄主的群体遗传结构差异性较大。     

MfSre1基因参与调控桃褐腐病菌对外源渗透的胁迫和对DCFs杀菌剂敏感性

 美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)引起的褐腐病是严重威胁桃生产的重要真菌性病害。为揭示该病原菌的抗药性机制和发掘新的药剂靶标,本研究利用同源重组分割标记法对MfSre1基因进行了敲除,并研究了该基因的生物学功能。与亲本甾醇14-α-脱甲基化酶抑制剂(DMI)抗性菌株Bmpc7相比,敲除转化子的菌落形态、菌丝生长速率、产孢能力和致病力没有显著变化(P>0.5),对DMIs杀菌剂的敏感性、过氧化氢和高浓度甘油渗透胁迫也没有显著性区别。但对金属离子、糖类、细胞壁/细胞膜破坏剂的敏感性明显降低,对二甲酰亚胺类杀菌剂(DCFs)的抗性水平显著上升。这些结果表明,MfSre1参与调控对部分外源渗透的胁迫和对DCFs杀菌剂的敏感性。     

MfMel1基因参与调控桃褐腐病菌对桃果实的致病力

为明确MfMel1基因在桃褐腐病菌Monilinia fructicola中的功能,利用生物信息学软件对该基因的结构、所编码蛋白的保守结构域以及进化关系进行分析;通过遗传转化方法对该基因进行敲除,并进行表型分析。结果显示,敲除转化子△MfMel1菌株的菌丝生长速率、孢子萌发率与野生型菌株Bmpc7均无显著差异,但产孢量显著降低。△MfMel1菌株在0.01%SDS、600μg/mL刚果红、150 g/L甘油、200 g/L蔗糖、6 mmol/L H2O2、4%NaCl和1.2 mmol/L山梨醇培养基上的生长速率、菌丝形态均无显著变化,但对200 g/L葡萄糖的渗透胁迫敏感性增强。敲除转化子△MfMel1菌株的α-半乳糖苷酶活性明显降低,对桃果实的致病力显著下降。表明MfMel1基因在桃褐腐病菌中可能通过参与调控α-半乳糖苷酶酶活,从而参与病原菌的致病。     

Cross-resistance relationships between benzimidazole fungicides and diethofencarb in Botrytis cinerea and their genetical basis in Ustilago maydis

After nitrosoguanidine- or UV-mutagenesis, three different benzimidazole-resistant phenotypes were isolated on media containing benomyl or a mixture of carbendazim and diethofencarb from wild-type strains of Botrytis cinerea Pers. ex Fr. and Ustilago maydis (D.C.) Corda. Mutants of B. cinerea with moderate (MBr) or low (LBr) resistance to benzimidazoles and high resistance to diethofencarb (Dr) were isolated from the fungicide-mixture-containing medium in low frequency (7–1 × 10^?8). Only benzimidazole-resistant strains highly sensitive to diethofencarb (HBrDs) were identified on benomyl-containing medium at a frequency of 6.6 × 10^?6. Fitness-determining characteristics such as sporulation, germination and germ-tube elongation, were found to be reduced significantly in the mutants of B. cinerea that were resistant to both benzimidazoles and diethofencarb. However, pathogenicity of a MBrDr mutant strain on cucumber seedlings was equal to that of the wild type and a carbendazim + diethofencarb mixture was found to control grey mould caused by the wild type, but was not effective when the plant cotyledons were infected by the mutant strain. Three benzimidazole-resistant phenotypes (HBrDs, HBrDr, MBrDr) were isolated easily in U. maydis from a benomyl-containing medium. In contrast with B. cinerea, only one-tenth of the benzimidazole-resistant strains were sensitive to diethofencarb. Genetic analysis of benzimidazole resistance in U. maydis showed that the three benzimidazole-resistant phenotypes were due to three allelic mutations in a single gene and one of them was responsible for the negative cross-resistance between benzimidazoles and diethofencarb.     

灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性

为明确灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性差异,将9个不同敏感型菌株在无药PDA平板上继代培养10代后,测定其对氟唑菌酰羟胺的敏感性。采用菌丝生长速率法分别在PDA平板和离体叶片上测定了其菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性,以及其对温度、pH值和葡萄糖的敏感性,并对其编码琥珀酸脱氢酶的SdhA、SdhB、SdhC和SdhD 4个亚基基因进行了克隆与测序。结果显示:从田间获得的2个低抗菌株、2个中抗菌株和2个高抗菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数在0.60~1.15之间,而通过室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数为0.23;除低抗菌株WP8的菌丝生长速率显著低于2个敏感菌株,以及中抗菌株WP6和高抗菌株WPE9的产孢量显著低于2个敏感菌株外,其余各抗性菌株在菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性方面均无显著差异。整体而言,7个抗性菌株在对温度、pH值和葡萄糖的敏感性方面与敏感菌株无显著差异。基因克隆及测序结果表明,室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F SdhB基因的272位由组氨酸变为了精氨酸 (H272R),田间获得的低抗、中抗和高抗各2个菌株均为SdhB基因的225位由脯氨酸变为了亮氨酸 (P225L)。综合分析表明,灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株具有相似的适合度。因此,推测在药剂的选择压下,抗氟唑菌酰羟胺的灰葡萄孢菌株在田间容易形成优势种群。     

小麦纹枯病菌对三唑酮不同敏感性菌株的生物学特性及对不同杀菌剂的敏感性

为预测小麦纹枯病菌对三唑酮抗药性的发展趋势,采用菌丝生长速率法测定了2013年分离自河南省16个地市的98株菌株对三唑酮的敏感性,比较不同敏感性菌株的生物学性状差异,并分析了其中22株菌株对其它10种杀菌剂的敏感性。结果表明:小麦纹枯病菌群体中已出现对三唑酮敏感性下降的菌株,其中有90株菌对杀菌剂的敏感性属于正态分布,以其EC_(50)均值1.91μg/mL作为小麦纹枯病菌对三唑酮的敏感性基线。敏感菌株菌丝生长速度较快,可达8.50~12.86 mm/d,菌核产量较多,为35.80~42.90 mg/皿,生存适合度较高;敏感性下降及抗性菌株的致病性及菌核萌发等都未发生改变,但菌丝生长速率仅为5.36~10.02 mm/d,菌核产量为9.00~36.90 mg/皿,均下降明显,生存适合度降低;低抗菌株与敏感菌株在菌落形态上相同,但菌丝分枝数增多且分枝菌丝变短。三唑酮对小麦纹枯病菌的毒力较小,EC_(50)大于其它10种杀菌剂;戊唑醇、氟环唑、烯唑醇、咯菌腈和噻呋酰胺的毒力均较大,其EC_(50)≤0.10μg/mL;其余5种杀菌剂的EC_(50)在0.13~0.69μg/mL之间;小麦纹枯病菌对三唑酮的敏感性与其它10种杀菌剂间的决定系数为0.003~0.200,存在微弱的正相关性,表明在生产中这些杀菌剂可与三唑酮轮换或交替使用。