来源于Chaetomium cupreum的几丁质酶chi58基因克隆及特性分析

以角毛壳菌cDNA文库中获得的几丁质酶基因片段(GenBank Accn:DV546055)为基础,用反向PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列,命名为chi58。其开放阅读框(ORF)1602bp,编码533个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为58kD,理论等电点为4.47。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成。经BlastP分析,chi58基因的氨基酸序列的保守性不高,与其相似性最高的是球毛壳菌(Chaetomium globosum XM001230073),相似性为75%。表明该基因是一条新发现的几丁质酶家族基因。该序列已收录于GenBank,登录号为EF026977,DQ886936。     

甘蔗14-3-3基因真核表达载体构建及分析

该实验拟构建甘蔗14-3-3基因的真核表达载体,为体外研究该蛋白功能和高级构象特征奠定基础。用RT—PCR技术从甘蔗茎中扩增出编码14-3-3蛋白的全长基因,并连入pGEM—T载体中,双酶切和测序用于序列正确性的鉴定。结果表明,该基因的最大开放阅读框为771bp,编码6256个氨基酸。后将所得cDNA片段亚克隆至真核表达载体pPIC9K,经电转后在酵母细胞中表达,表达产物经Westernblot鉴定分子量约为28kD。表明已成功构建了甘蔗14—3—3蛋白真核表达载体,并获得了表达产物。     

农业害虫铅灰齿爪鳃金龟气味受体基因Or83b的克隆及序列分析

采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从农业害虫铅灰齿爪鳃金龟中分离和克隆了一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因(命名为Hp-Or83b)全序列。Hp-Or83b全长共1822 bp,5’-UTR为168 bp,3’-UTR为220 bp,开放阅读框全长1434 bp,编码478个氨基酸,预测分子量为54.24 kDa,等电点为7.46。通过同源性比较,发现Hp-Or83b氨基酸序列与已知的其它昆虫的Or83b具有较高的同源性。因此推断所获得的cDNA序列为农业害虫铅灰齿爪鳃金龟气味受体基因Or83b的cDNA序列。     

野蚕孵化酶基因的克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR法从野蚕胚胎中克隆了一个885 bp孵化酶基因,命名为BmandHE(GenBank登录号:JN620366)。BmandHE ORF编码294个氨基酸残基,蛋白分子质量为33.57 kD,等电点为5.55。在BmandHE N-端存在16个氨基酸的信号肽,BmandHE序列含有锌指结合序列、Met-转角基序等孵化酶保守功能区域和构成孵化酶二级结构骨架的4个半胱氨酸残基。BmandHE与其他动物孵化酶氨基酸序列的相似性为30.4%～97.1%。进化分析表明,野蚕与昆虫家蚕、柞蚕、家蚊聚为一类,亲缘关系比较近。     

柽柳dir基因的克隆及序列分析

在柽柳cDNA文库测序中获得了dir基因的全长cDNA序列,去除PolyA后,该基因全长为724bp,其中5′非翻译区26bp,3′非翻译区143bp,开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸.基因编码蛋白的分子量为19·69kD,理论等电点为6·96·疏水性分析表明,蛋白的前41个氨基酸为亲水性的.dir基因编码的蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.该基因的Genbank登录号为DQ462418(基因)和ABE73781(蛋白).     

茶卷叶蛾寄生真菌球孢白僵菌几丁质酶基因的克隆与序列分析

球孢白僵菌是最重要的虫生真菌之一,在农林害虫生防中发挥着重要的作用。本研究从茶卷叶蛾球孢白僵菌JYBb201-11菌株中克隆了几丁质酶Bbchit1基因(GenBank登录号:HQ435871)。根据GenBank上昆虫病原真菌几丁质酶基因序列同源性设计引物,分别进行DNA-PCR和总RNA-RT-PCR反应,对得到的目的片段,回收纯化后通过PMD18-T载体转化到大肠杆菌DH5α中,获得几丁质酶基因序列的重组质粒PMD18-chit,并测序。结果表明,DNA-PCR和总RNA-RT-PCR获得的基因序列完全一样,都是一个完整ORF序列,含1 047bp核酸序列,编码348个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,成熟蛋白理论分子量约为36.78kD,理论等电点为5.95。该蛋白序列中包含2个保守区域,即底物结合区域(SIGG)和几丁质的活性位点(DGIDIDIE),该蛋白可归为几丁质酶18族V类。氨基酸序列同源性分析表明,球孢白僵菌JYBb201-11菌株几丁质酶与球孢白僵菌Bb0062菌株(AAN41259)和NCIM1216菌株(ACF32998)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性都达99.43%;与球孢白僵菌MTCC 2028菌株(ACZ28129)几丁质酶chit1氨基酸序列同源性达98.28%。     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

山葡萄北冰红VvCOR413-I1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18 k D,等电点(p I)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。     

萝卜STP13.2基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术克隆了萝卜（Raphanus sativus L.）STP13.2基因CDS序列，并对其进行测序和生物信息学分析。结果表明：RsSTP13.2 CDS序列全长1599 bp，编码532个氨基酸残基，分子式为C2678H4191N685O713S21。相对分子量为58.1 kD，理论等电点为9.29，脂肪指数为108.12，是稳定蛋白。RsSTP13.2蛋白包含12个跨膜结构，预测其可能定位于细胞膜；系统进化分析表明其与白芥、甘蓝型油菜和白菜等多个不同物种具有较高的同源相似性。本研究为下一步STP13.2基因的功能和表达调控机制研究奠定了基础。     

牛瑟氏泰勒虫P23基因的克隆与生物信息学分析

[目的]为研制牛瑟氏泰勒虫病基因工程苗和诊断试剂盒提供依据。[方法]通过PCR方法从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中克隆了1个P23基因,连接到pGEM-T-Easy载体中。运用生物信息学方法对该基因进行分析。[结果]P23基因全长为684 bp,包含1个长672 bp的开放阅读框,编码223个氨基酸,相对分子量是25.886 kD,等电点pI为9.22,包括1段19个氨基酸组成的信号肽和2段跨膜区。该序列在GenBank上的注册号为EU573168,与瑟氏泰勒虫Chitose型(D84446)和Ikeda型(D84447)的同源性分别为99%、90%。[结论]P23基因编码的蛋白有较好稳定性和免疫原性,可作为制备牛瑟氏泰勒虫基因疫苗的候补抗原。     

牛瑟氏泰勒虫P23基因的克隆与生物信息学分析(英文)

[Objective] The aim of this study is to provide basis for developing genetic engineering vaccine and diagnostic kit for Theileria sergenti infection. [Objective] P23 gene of Theileria sergenti was amplified from its genomic DNA by PCR amplification, and cloned into the pGEM-Easy vector; then the sequencing result was analyzed with bioinformatics methods. [Result] Whole length of the P23 gene from Theileria sergenti is 684 bp containing a 672 bp open reading frame. The deduced amino acid sequence (223 amino acid residues) contains a signal peptide of 19 amino acid residues and two fragments of transmembrane domains, with relative molecular weight of the 25.886 kD and with the pI of 9.22. The homology between the yielded sequence and Chitose of Theileria sergenti P23 gene(TS-Chitose type, D84446), Ikeda of Theileria sergenti P23 gene(TS-Ikeda type, D84447) reached 99% and 90%, respectively. The sequence has been accessed in GenBank(EU573168). [Conclusion] The protein encoded by the P23 gene has better stability and immunogenicity, thus can be used as the antigen candidate for preparing genetic engineering vaccine for Theileria sergenti.     

葡萄雌能花相关基因VvMS2的克隆及表达分析

【目的】从欧亚种葡萄‘魏可’和‘钟山红’的花中分离出VvMS2基因,为研究葡萄雌能花形成的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列（CBI29968）,设计特异引物进行克隆测序,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’各组织中及‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。【结果】VvMS2基因cDNA编码区全长为1 755 bp,编码584个氨基酸,含有NAD结合域和雄性不育C-末端区域。VvMS2对应基因组DNA全长2 776 bp,含有9个外显子和8个内含子。基因编码蛋白质分子量为64.74 kD,等电点为8.84。该基因与GenBank中其它来源的MS2蛋白序列的相似性为40%—71%。VvMS2为花蕾特异表达基因,且仅在花粉发育四分体期到二核期有表达,单核期‘魏可’的表达量显著高于同时期‘钟山红’。【结论】推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。     

翻译起始因子(eIF1A)基因的获得及抗旱性分析

从柽柳cDNA文库中测序得到一条长度为631bp,编码113个氨基酸的全长cDNA基因序列,利用生物信息学软件对该基因进行分析,确定其属于eIF1A家族。采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化,通过分子检测证明eIF1A基因已经整合到烟草基因组中,并且在mRNA水平上得到不同程度的表达。对各转基因烟草及非转基因对照烟草进行旱胁迫处理,测定抗逆生理指标、生长量大小。结果证明,柽柳的eIF1A基因具有提高烟草的抗干旱能力。     

大肠杆菌Top10Na~+/H~+反向运输体A基因的克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的Na+/H+反向运输体(Na+/H+antiporterA,nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了nhaA基因(Acession Numeber:EU368045)。nhaA开放阅读框为1 167 bp,编码含有388个氨基酸残基,分子量为41.3 kDa的蛋白,预测等电点为9.23。nhaA含有25个碱性氨基酸,19个酸性氨基酸,211个疏水氨基酸及63个极性氨基酸。二级结构预测表明,该蛋白含约50%的α-螺旋、18%的延伸链、7%的β-转角和25%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,nhaA是疏水性蛋白。跨膜结构进行分析显示该蛋白含有11个跨膜区域。序列分析表明,大肠杆菌Top10 nhaA基因与大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HS、大肠杆菌SECEC SMS-3-5和大肠杆菌CFT073的nhaA基因同源性分别为100%、98%、95%和92%。大肠杆菌Top10 nhaA基因的克隆及生物信息学分析为今后对nhaA的进一步深入研究奠定了基础。     

米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析

采用PCR技术从米曲霉CICC2012菌株基因组中克隆6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd),并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、蛋白质结构等进行分析.序列测定和分析结果表明.gnd基因序列长为1 723 bp.包含1个1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸;gnd基因编码的6PGDH氨基酸序列与黄曲霉6PGDH基因的同源性为99％,存在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点分别有11,2和6个;6PGDH蛋白分子量为57.3 kD,等电点为5.63; gnid基因编码蛋白二级结构α-螺旋区域占44.57％,β-折叠区域占12.79％.无规则卷曲区域占42.64％;氨基酸残基11～195位点为NADP+结合区域.     

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。     

棉铃虫中肠氨基氨肽酶N基因的克隆及序列分析

 通过简并引物PCR结合RACE技术 ,从棉铃虫中肠中克隆了 1个氨基氨肽酶N基因 ,该基因全长 30 4 3bp ,阅读框包括 2 85 6bp ,编码 95 1个氨基酸。预测蛋白分子量为 10 8.3kD ,等电点为 5 .2 9。序列中具有谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN以及锌结合位点HEXXHX18E。N 末端 2 0个氨基酸具有信号肽的特征 ,C 末端 2 5个氨基酸具有明显的亲脂性 ,并且具有跨膜特征。该基因已经在GenBank中登记 ,序列号为 :AY1810 2 6。     

黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析

黑灵芝(Ganoderma astum)是灵芝家族中一个重要成员,克隆和分析黑灵芝免疫调节蛋白基因,可为进一步了解真菌免疫调节蛋白在种群中的分布打下基础。以黑灵芝为材料,采用同源克隆方法,对真菌免疫调节蛋白(FIPs)基因进行PCR扩增,并对其核苷酸编码序列进行了生物信息学分析。结果表明:黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因序列包含336bp,可编码111个氨基酸残基,命名为FIP-gas。FIP-gas分子量为12.4kD,理论等电点为4.80,符合FIPs的特性,是FIPs家族一新成员。对FIP-gas进行序列分析发现其氨基酸序列具有FIPs的保守序列模式,与紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢灵芝(G.microsporum)、赤灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)及草菇(Volvariella volvacea)的FIP序列的同源性分别为99%、98%、87%、86%、86%、61%、55%。系统进化树分析表明黑灵芝的FIP与紫芝的FIP亲缘性最高,与金针菇和草菇的FIP亲缘性相对较远。该研究为进一步了解免疫调节蛋白在灵芝种群中的分布提供了较详细的数据。