沙田柚乙烯应答因子的鉴定和生物信息学分析

利用高通量测序对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到了沙田柚乙烯应答因子基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析。该基因全长为1013 bp(Gen Bank登录号为MG905213),开放阅读框(ORF)全长498 bp,编码的蛋白质含166个氨基酸。编码蛋白质的相对分子量为18.45 k Da,理论等电点为7.90。该蛋白质具有一个与AP2 superfamily蛋白相同的保守结构域,为亲水性非分泌不稳定蛋白,不属于跨膜运动,共有24个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白质与芸香科的甜橙(Citrus sinensis,XP-006467696.1)和克莱门柚(Citrus clementina,XP-006449381.1)的AP2蛋白的同源性分别为100%和98%。系统进化树表明,沙田柚的乙烯应答转录因子与甜橙和克莱门柚亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

沙田柚F-box蛋白基因的克隆及序列分析

采用生物信息学方法,对沙田柚[Citrus maxima(Burm.)Merr.cv.Shatian Yu.]F-box蛋白基因编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明,该基因全长为1 427 bp(Gen Bank登录号为KR363148),开放阅读框(ORF)全长为1 101 bp,共编码366个氨基酸,编码蛋白质的分子质量43.09 ku,理论等电点5.15。沙田柚F-box蛋白基因编码蛋白含有一个植物F-box蛋白家族的保守结构域,为亲水性非分泌不稳定蛋白,不跨膜运动,共有30个可能的磷酸化位点。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)F-box蛋白的同源性分别为99%、98%。系统进化树表明,沙田柚F-box蛋白基因与与甜橙(Citrus sinensis,KDO71185)和克莱门柚(Citrus clementina,XP_006425495)亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

沙田柚PIF5基因的鉴定及序列分析

对沙田柚的PIF5转录因子基因进行鉴定和序列分析。生物信息学分析结果表明,该基因全长2 323 bp(Gen Bank登录号:MH020222),含有1 512 bp的开放阅读框(ORF),共编码503个氨基酸,编码蛋白质的分子质量为54.95 kDa,等电点PI为5.12。该蛋白质含有一个PP2Cc保守结构域,为亲水性稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,该氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)和甜橙(Citrus sinensis)相似性很高,相似度分别达到100%和99%。系统进化分析发现沙田柚的PIF5转录因子基因与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近,属于同一分支。转录组测序结果表明:PIF5基因在沙田柚在未授粉花柱中的表达量(RPKM)为2.94,自花授粉1、2、3 d花柱中的表达量(RPKM)分别为4.35、3.74、3.99,在异花授粉1、2、3 d花柱中基因的表达量(RPKM)则分别为3.39、1.70和0.98。     

沙田柚类蛋白激酶基因的鉴定及生物信息学分析

[目的]研究沙田柚类蛋白激酶基因编码的蛋白质序列所包含的生物信息学。[方法]利用高通量测序对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到沙田柚类蛋白激酶基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行预测和分析。[结果]该基因全长为2 323 bp,开放阅读框(ORF)全长为1 560 bp(Genbank登录号:MG925820),共编码519个氨基酸,分子质量为57.39 kD,等电点PI为8.55。该蛋白质含有1个植物STKc IRAK蛋白家族的保守结构域,为亲水性稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与克莱门柚和甜橙的同源性分别为100%、99%。系统进化树表明沙田柚类蛋白激酶基因与克莱门柚和甜橙亲缘关系很近,属于同一进化分支。[结论]该研究结果可为今后深入研究沙田柚自交不亲和机理提供参考。     

沙田柚生长素响应基因SAUR的鉴定及序列分析

[目的]研究沙田柚生长素响应基因SAUR基因编码的蛋白质序列所包含的生物信息学。[方法]以沙田柚自交和异交花柱为材料,通过高通量测序技术进行转录组测序,在差异表达基因中鉴定出SAUR基因。[结果]该基因全长857 bp(登录号为MH281940),开放阅读框(ORF)为381 bp,编码126个氨基酸,编码的蛋白质理论等电点为5.76,相对分子质量为13.74 kD,含有1个与Auxin_inducible superfamily蛋白相同的保守结构域。沙田柚SAUR基因在自交1～3 d花柱中的表达量(RPKM)分别为8.42、56.02、53.45;而在异交1～3 d花柱中的表达量分别为11.98、36.74、8.53。氨基酸序列分析表明,该基因编码的氨基酸与克莱门柚和甜橙SAUR基因编码的氨基酸的同源性分别为100%、99%。系统进化树显示,沙田柚SAUR基因与克莱门柚和甜橙的亲缘关系很近,属同一进化分支。[结论]研究结果可为今后深入研究沙田柚自交不亲和机理提供参考。     

沙田柚热激蛋白HSP90基因的鉴定分析

为探明沙田柚自交不亲和分子机理,以沙田柚(Citrus grandis var.Shatianyu Hort)自交和异交花柱为材料,对其进行转录组测序;通过差异分析获得相关基因,并研究其理化性质。结果表明:获得的Hsp90基因全长2 602bp(GenBank登录号:KU517851),开放阅读框(ORF)全长为2 100bp,编码699个氨基酸,编码的蛋白质分子量为80.55KDa,理论等电点为5.01,含有1个与HSP90超家族(HSP90superfamily)相同的保守结构域。沙田柚Hsp90蛋白氨基酸的同源性与甜橙(XM_006490568)、克莱门柚(XM_006421973)亲缘关系较近,同源性高达99%,属同一进化分支。     

沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因的鉴定及序列分析

利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到GDSL酯酶/脂肪酶的基因序列,该基因全长1 306 bp(Gen Bank登录号:KU159279),开放阅读框(简称ORF)全长1 104 bp,共编码367个氨基酸,编码的蛋白质分子量为40.09 ku,理论等电点为6.44,含有1个与SGNH蛋白相同的保守结构域(conserved active sites,简称CAS);GDSL基因在沙田柚自交1 d花柱中的表达量(简称RPKM)为4.68,2 d为2.41,3 d则迅速下降到0.27;在异交1 d花柱中该基因的表达量为4.48,2 d迅速升高至7.43,3 d仍维持较高水平为4.37;系统进化树显示,沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因与甜橙(Citrus sinensis)亲缘关系很近,属于同一进化分支。     

芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用.     

草莓乙烯响应因子FaERF003基因克隆与表达模式分析

[目的]为了探明乙烯响应因子FaERF003在草莓果实成熟中的作用.[方法]转录组测序和实时荧光定量PCR检测FaERF003基因在草莓果实不同发育时期的表达水平,利用生物信息学方法分析FaERF003 DNA结合域的氨基酸序列与蛋白质结构,烟草叶片瞬时转化分析FaERF003亚细胞定位.[结果]FaERF003基因CDS区全长894 bp,编码297个氨基酸,预测FaERF003蛋白的分子量为32.9 kD,等电点为8.55,属于AP2/ERF蛋白超家族.FaERF003在草莓果实成熟过程中表达迅速升高且与乙烯前体ACC含量变化趋势相似,推测该基因与乙烯信号转导相关.FaERF003蛋白定位于细胞核和胞质.[结论]FaERF003可能作为乙烯响应因子与乙烯调控草莓果实成熟密切相关.     

茶陵野生稻DREB类转录因子的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB.     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

龙眼中性转化酶基因(DlNI)的克隆及分析

【目的】中性转化酶是果实蔗糖代谢关键酶之一,克隆中性转化酶基因对于揭示龙眼果实糖代谢具有重要的意义。【方法】以‘石硖’龙眼试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列。【结果】3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列分别命名为DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3,NCBI登录号为KP769773、KP769774和KP769775,其中DlNI-1全长2090 bp,编码589个氨基酸,比对结果发现与木薯(82%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-2全长2558 bp,编码709个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-3全长2444 bp,编码805个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高。3个龙眼中性转化酶基因的氨基酸序列都具有中性转化酶的12个高度保守的结构域,并且都具有2个催化残基,推测其蛋白都属于α类,且都定位于细胞器中。3个基因在不同组织中表达量具有较大差异,其中DlNI-1和DlNI-2在叶片中都具有较高的表达量,而DlNI-3在果皮组织中具有最高的表达量。【结论】成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因,为后期深入研究中性转化酶基因结构和功能奠定基础。     

草莓FaSig转录因子基因的克隆及序列分析

Sigma因子作为一个转录正调控因子参与微生物糖代谢的调控。为了研究果实中Sigma因子的功能,利用RT-PCR与RACE扩增方法,从草莓果实cDNA中分离出一个草莓Sigma转录因子cDNA全长,进行测序和序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段全长为2 008bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,可编码长度为520个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与葡萄(XM002268673)、大豆(XM003544709)、苜蓿(XM003602150)Sigma转录因子基因分别具有78%,77%和77%的氨基酸序列同源性,并含有典型的HTH结构域,表明草莓果实中Sigma属于σ70家族。     

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.     

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。     

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明,纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达,该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强,而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b,其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员,可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因,ORF全长756 bp,编码252个氨基酸;其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR);与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对,结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%;与梅树CBF相似性为67%;进一步构建了植物表达载体,为利用CBF基因提高植物抗逆性奠定基础。     

甘蓝型油菜BnaWRKY30-like基因cDNA序列克隆 及生物信息学分析

WRKY 转录因子是植物所特有的一个超级基因家族,能调控植物生长发育过程及逆境反应。根据转录组测序获得的 EST 序列设计引物, 利用 RT-PCR 及 RACE 技术克隆了甘蓝型油菜WRKY30 基因 cDNA 全长序列, 并运用生物信息学手段对序列进行了分析及预测。结果表明：BnaWRKY30-like 基因全长cDNA序列中包含102 bp 的5′-UTR序列,188 bp 的3′-UTR序列以及942 bp的完整ORF,编码313个氨基酸。该转录因子蛋白相对分子量为35 319.85D,等电点为 6.22,基本氨基酸中含量最高的丝氨酸（Ser）,313个氨基酸中含有41个酸性氨基酸,34个碱性氨基酸,在121～182区域含有一个典型的WRKY结构域。亚细胞定位预测发现该转录因子定位于细胞核的可能性最高。蛋白质的二级结构预测表明共有α-螺旋占26.20%,延伸链占10.54%,β-转角占4.47%,无规则卷曲占58.79%。BnaWRKY30-like基因编码的蛋白具有典型的WRKY转录因子特征,与拟南芥WRKY30基因亲缘关系近,可能在油菜早期生长发育过程及盐胁迫中的发挥调控作用。