不同生态条件下棉花赤霉素合成代谢途径关键酶基因差异表达分析

为揭示棉花植株体内赤霉素合成途径关键酶基因表达量与不同组织及环境条件的关系,以"中棉所49"(CCRI49)和"高脚棉"(396289)为材料,利用实时荧光定量PCR方法中的相对定量,以UBQ7为内参基因,对新疆维吾尔自治区阿拉尔和河南省安阳,2种不同生态环境下的CCRI49和396289不同组织内赤霉素合成途径相关基因的表达量进行检测。结果显示,在阿拉尔地区生长条件下,CCRI49果枝始生节位相比于安阳地区平均降低2.0,高脚棉平均降低2.6。在安阳地区,CCRI49和396289中赤霉素合成途径各关键酶基因在不同组织内的表达趋势基本一致,茎组织中各相关基因表达量高,为植株生长提供充足的活性赤霉素;在新疆阿拉尔地区,CCRI49和396289主要表现为赤霉素合成早期阶段CPS1、KS和KO等基因的表达量下调,GA2ox1表达量上调,以减少活性赤霉素的合成。结果表明,棉花植株赤霉素合成代谢途径关键酶基因的表达量发生改变,从而调控植株的生长发育来适应新疆干旱和盐渍化的生长环境。     

萝卜花变叶病病原鉴定及赤霉素合成与代谢途径中关键酶基因的表达

【目的】明确云南元谋地区发生的萝卜花变叶病病原以及赤霉素合成途径中关键酶基因表达量的变化。【方法】对自然表现花变叶、丛枝和节间缩短的萝卜感病植株总DNA进行植原体16S rRNA基因扩增、克隆、测序及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术分析赤霉素合成及代谢途径中关键酶基因(GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1)表达量的变化。【结果】该植原体株系与16SrⅡ-A亚组相似性最高(0.98),并与16SrⅡ-A亚组中的其他植原体株系明显形成一个进化支。【结论】萝卜花变叶植原体(Raphanus sativus phyllody,RsPh-YNym)为植原体16SrⅡ-A亚组成员,且与候选种Candidatus Phytoplasma aurantifolia相关,明确了该株系的分类地位;感病植株茎中3种关键酶基因GA20ox1、GA3ox1和GA2ox1表达水平发生了变化,表达量均下调,说明植原体的侵染造成了植株赤霉素稳态被破坏,从而导致植株表型改变。     

黄瓜CsGA20ox1异源表达促进拟南芥植株发育

GA20ox1在植物的种子萌发和植株生长发育过程中起着重要的作用,而黄瓜CsGA20ox1基因在植株生长发育的作用尚不明确。本实验以黄瓜和拟南芥为材料,采用同源克隆和PCR技术分离克隆了黄瓜赤霉素20-氧化酶基因CsGA20ox1,对黄瓜CsGA20ox1基因在植株生长发育的作用进行了初步探究。系统进化树分析显示,CsGA20ox1与At GA20ox1亲缘关系最近;基因表达分析表明CsGA20ox1在黄瓜幼叶和开花当天的子房中表达量较高。亚细胞定位表明黄瓜CsGA20ox1同时在细胞核和细胞质中表达。通过农杆菌介导的遗传转化获得CsGA20ox1超量表达拟南芥转基因植株,拟南芥转基因植株的发芽速率得到显著提高,并且莲座叶面积、叶片面积和叶柄长度显著增大。DIC实验统计结果表明CsGA20ox1增大了表皮细胞面积。     

Aux/IAA家族基因GhAux1沉默促进棉花幼苗的生长

为明确Aux/IAA家族基因GhAux1在棉花幼苗生长发育中的功能,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术构建了重组表达载体pTRV-GhAux1,转化农杆菌并注射到棉花幼苗子叶,采用qRT-PCR检测GhAux1沉默效率,并对GhAux1沉默植株的表型、内源生长素(IAA)含量和赤霉素(GA_4)含量以及GA合成关键酶基因的表达进行了分析。结果表明,成功建立了VIGS体系,注射含pTRV-GhAux1的菌液后15 d,GhAux1在沉默植株中的表达量仅为空载体对照的26%;注射含pTRV-GhAux1的菌液后24、27、30 d,GhAux1沉默植株的株高较空载体对照分别显著增加了18%、27%、20%,其中注射后27 d达到极显著水平;注射含pTRV-GhAux1的菌液后21、24、27 d,GhAux1沉默植株的节间内源GA_4含量比空载体对照分别增加了33%、20%、33%,且GA合成关键酶基因GhGA20ox1、GhGA20ox2和GhGA3ox1的表达量均显著或极显著增加,而IAA含量仅在注射后27 d显著增加。表明GhAux1参与IAA与GA的互作,可调控GA合成途径下游基因的表达,抑制棉花幼苗的生长。     

NtCPS2基因对顺-冷杉醇与赤霉素合成代谢途径的影响

为探讨顺-冷杉醇合成基因NtCPS2对萜类代谢途径的影响,利用基因编辑技术CRISPR/Cas 9编辑烟草顺-冷杉醇合成基因NtCPS2,并筛选出纯合突变植株,命名为‘8306’编辑系;比较‘8306’编辑系(T_2-26、T_2-45、T_2-48)与野生型(WT)在顺-冷杉醇、赤霉素含量及合成关键基因的生物信息学方面的差异。结果表明:‘8306’编辑系(T_2-26、T_2-45、T_2-48)顺-冷杉醇含量平均减少86.20%,赤霉素含量平均增加27.05%;顺-冷杉醇合成途径中的关键基因表达量显著减小,赤霉素合成途径中正调控关键基因GA20ox表达量显著增加,负调控关键基因GA2ox表达量显著减小,并且GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)合成的关键基因DXR表达量增加。NtCPS2基因不仅影响赖百当类二萜代谢途径,有效降低顺-冷杉醇的含量,并且影响赤霉素萜类代谢,增加赤霉素的含量。     

赤霉素对根尖径向生长的调节作用研究

通过转基因与RNAi 基因沉默技术,获得了由35S 组成型启动子和TobRB7 根尖特异表达型启动子分别启动 表达的PtGA20ox、PtGA2ox1 烟草转基因株系和NtGA20ox RNAi 株系,对转基因植株根尖进行大样本(n 100)显微 观察。统计结果显示:转基因植株根尖径向生长与对照相比具有极显著差异,外源施用GA3 与赤霉素合成抑制剂 PAC 可以逆转这种差异,表明赤霉素对根尖径向生长具有负调控作用;此外,利用TobRB7 启动子在根尖分生组织 特异上调和下调内源赤霉素水平可以得到与组成型调控转基因植株相似的表型,表明赤霉素对根尖径向生长的负 调控作用主要是通过对根尖分生组织生长发育的调控实现的。      

葡萄赤霉素合成关键基因VvGA20ox2的克隆、亚细胞定位和表达分析

本研究建立在对金手指葡萄果形转录组分析的基础上,通过分析样品间表达差异发现,与对照相比,GA20ox2基因的转录水平在GA3处理后有显著差异。为了进一步从分子水平阐述GA20ox2在赤霉素合成途径中的作用机理,本研究以金手指葡萄幼果为材料,克隆了GA20ox2基因,分析了此基因碱基序列特征,并通过构建融合表达载体对其进行亚细胞定位分析。研究结果表明,克隆了葡萄赤霉素合成途径中的VvGA20ox2基因,测序得CDS全长为1 134 bp,编码377个氨基酸。VvGA20ox2编码的氨基酸序列与NCBI上其他物种GA20ox序列相似性在51%～67%,其中该基因与可可(EOX92603.1)和杨树(PNT28192.1)的亲缘关系较近。该基因定位在细胞核和细胞膜中。外源GA3处理后的成熟葡萄果实与对照相比纵径显著伸长,且在幼果中该基因表达量在一段时间内明显上升,推测VvGA20ox2基因可能参与葡萄果形拉长的调控。     

杨树PsnGA20ox1过表达对烟草叶片发育的影响

目的赤霉素(Gibberellins, GA)参与植物多个生长发育过程,然而赤霉素在植物叶片发育中的生物学功能尚无研究报道。GA20ox是GAs生物合成途径中关键限速酶(GA20-oxidases)的编码基因,本项研究目的是揭示PsnGA20ox1在植物叶片发育中的生物学功能。方法本项研究分析了PsnGA20ox1在烟草中过表达后对烟草叶片大小、超微结构、生物量、叶绿素及生物活性GAs含量,以及细胞分裂与气孔发育相关的基因表达的影响。结果PsnGA20ox1过表达烟草叶片变大、叶绿素与GA₄含量上升,叶片表皮细胞变小。而且,转基因烟草叶片栅栏组织与海绵组织厚度、表皮细胞与气孔数目、光合作用和叶片生物量与野生型烟草相比均显著增加。此外,转基因烟草叶片气孔与表皮细胞发育相关基因表达也发生了显著变化,而且变化趋势与叶片表型的改变相吻合。结论PsnGA20ox1过表达影响植物叶片的结构与功能,从而提高了叶片的生物量。      

低温胁迫对赤霉素代谢的调控研究

通过4℃处理,对模式植物拟南芥与烟草赤霉素(GA)代谢相关基因的表达进行了分析,结果表明:低温胁迫 抑制赤霉素前体GGPP 合成通路众多基因的表达,而促进催化GA 失活酶编码基因及赤霉素受体基因的表达。通 过对超表达PtGA20ox、PtGA2ox1 及AtCBF1 的转基因烟草及4℃处理野生型烟草植株GA1 含量及代谢相关基因的 表达分析表明,低温胁迫下,GGPP 合成与GA 失活酶编码基因的表达属于主动调控,低温响应通路中关键因子 CBF1 可能参与了此调控过程,而赤霉素受体基因表达受到了低水平GA 的反馈调控。该研究揭示低温胁迫下生长 延滞可能是植物主动响应环境变化的过程,通过抑制前体积累及加速失活而降低GA 水平可能在植物适应低温胁 迫过程中发挥着重要作用。      

外施赤霉素对薄壳山核桃幼苗生长及相关代谢基因表达的影响

  目的  研究赤霉素(gibberellin)对植物株高的影响,探讨了GA20ox、GA3ox和GA2ox在赤霉素合成过程中的反馈调节机制。  方法  以薄壳山核桃Carya illinoensis幼苗为材料,进行100 mg·L?1 赤霉素叶面喷施处理。对外施赤霉素后薄壳山核桃的株高、节间长度和主根长以及薄壳山核桃GA20ox、GA3ox和GA2ox的时空变化进行了研究。  结果  外施赤霉素28 d后,薄壳山核桃节间长度和主根长的伸长量与对照相比都存在显著差异(P＜0.05),节间数量没有发生变化;植株平均生长量达2.9 cm,为对照的1.93倍,差异极显著(P＜0.01)。实时荧光定量PCR结果表明:GA20ox、GA3ox和GA2ox在薄壳山核桃生长期存在时空表达差异。外施赤霉素能够使CiGA20ox的表达量持续下降,28 d后的表达量仅为初始值的38.6%;而CiGA3ox表达量则是在7 d时跌落低谷,下降至初始值的55.4%,28 d后回升,表达量为初始值的350%;CiGA2ox表达量总体呈波浪形变化,在7 d后达到顶峰,之后有所回落,至21 d时恢复到了初始水平,28 d后上升为初始值的220%。CiGA3ox在薄壳山核桃植株茎杆内发生了累积,相较于CiGA20ox和CiGA2ox在转录水平上发生了较大的变化。  结论  外施赤霉素促进了薄壳山核桃茎杆伸长,同时引起了薄壳山核桃体内赤霉素代谢关键基因表达模式的时空变化。图6表1参29     

茎部形成层赤霉素在植物生长发育中的调控作用

目的赤霉素(GAs)是一种重要的植物激素,对植物生长发育具有广泛的调控作用。本文通过对茎部形成层赤霉素在植物生长发育中的调控作用进行研究,为阐明植物体内源活性GAs的运输及其调控作用提供参考。方法本研究通过转基因方法特异下调烟草茎部形成层活性GAs含量,探究其对植株茎部、叶片、根生长发育的调控作用;在此基础上,利用35S:: PtGA20ox、35S:: PtGA2ox1转基因烟草株系分别作接穗和砧木进行微嫁接和施加外源GAs,探究内源与外源活性GAs在烟草体内的运输特性。结果结果表明,茎部形成层特异启动子LMX5介导的PtGA2ox1转基因烟草植株茎部GAs含量与野生型相比显著降低,而叶与根中含量无明显变化;通过石蜡切片观察发现茎部形成层GAs含量降低明显延缓了茎部木质部的发育,同时对植物的叶片、侧根的生长也有抑制作用;对不同转基因株系微嫁接分析发现,外源施加的GAs可以恢复茎部形成层GAs缺乏引起的表型,而内源活性GAs却不能自由运输,也不能恢复表型;结论茎部形成层GAs含量不仅对茎部木质部的发育有重要作用,并且对叶片的生长及不定根的发育也有调控作用,利用微嫁接的方法验证了活性GAs在烟草中的运输机制,明确了GAs在调控植物组织发育中的重要意义,为今后GAs在林木中的应用奠定了理论基础。      

苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的克隆及功能分析

【目的】从‘苏帅’苹果(Malus domestica)中分离克隆赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框(ORF),分析其序列特征及在苹果中的组织表达特异性,通过在烟草中过表达MdGA2ox8研究其对烟草生长发育的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR方法从苹果中克隆出MdGA2ox8的ORF区。利用NCBI、DNAMAN和Pfam在线软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MdGA2ox8氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;利用SignalP和TMHMM Server V.2.0分别在线分析蛋白质的信号肽和预测蛋白质的跨膜结构域;利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达量。构建MdGA2ox8过表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化技术将MdGA2ox8导入烟草中,获得具有潮霉素抗性的转基因烟草植株,通过GUS染色、基因组PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性植株;将野生型和转基因烟草移栽后,在第一朵花开放时测定转基因烟草的株高、节间长度和叶片长宽比以及烟草叶片叶绿素含量,激素GA1和GA4含量,并通过RT-qPCR方法分析烟草中相关基因的表达水平。【结果】成功克隆并获得了长为1 122 bp的MdGA2ox8 ORF区,编码373个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为42.8 kD,理论等电点为5.44,不稳定系数为49.73,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽,为非分泌蛋白。序列系统进化分析结果显示MdGA2ox8与白梨GA2ox8亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,MdGA2ox8在苹果各组织中差异表达,在花中的表达量最高,其次为老叶幼叶韧皮部,在木质部和幼果中几乎不表达。将MdGA2ox8转入模式植物烟草中,获得了5个转基因阳性株系。与野生型相比,过表达MdGA2ox8烟草植株GA4含量降低,GA1含量有所升高,其中野生型和转基因烟草GA1平均含量分别为1.26和1.75 ng·g-1,GA4平均含量分别为5.43和1.07 ng·g-1。与野生型相比,转基因烟草植株GA1和GA4总含量降低,使植株节间缩短、矮化以及花期推迟,其中野生型和转基因烟草植株平均高度分别为38.50和7.36 cm,节间长度分别为9.5和3.3 cm;转基因烟草叶片颜色深绿,叶片长宽比降低。烟草内源赤霉素合成途径相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达水平受MdGA2ox8的正反馈调节。【结论】获得苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框,MdGA2ox8具有组织表达差异性。MdGA2ox8过表达烟草植株中GA1和GA4总含量降低,导致植株节间长度缩短、植株矮化。     

柱型与普通型苹果茎尖组织中 GA2ox基因的序列比较及表达量分析

以柱型苹果舞姿和普通型苹果富士茎尖为试材,克隆赤霉素合成代谢途径中的关键酶基因GA2ox,并对二者茎尖组织中GA2ox基因进行序列比较和表达分析。结果表明,两品种中GA2ox基因cDNA序列长度均为1 014bp,编码337个氨基酸。cDNA序列中存在2处单核苷酸差异,其中1处差异会引起编码氨基酸的改变。与已发表的苹果基因组中同源序列的比较分析表明,舞姿和富士cDNA序列上的差异不是造成柱型性状的原因。同时,利用实时荧光定量PCR方法,对两品种及其杂交F1代杂种的检测表明,柱型苹果茎尖中GA2ox基因的表达量明显低于普通型苹果。     

花生半矮化突变体sdm1的表型分析与赤霉素响应研究

本研究利用快中子辐照花生山花13号的干种子,获得了一个性状稳定遗传的花生半矮化突变体sdm1(semi-dwarf mutant 1),继而对其矮化形态、经济性状指标及赤霉素响应特性进行了分析。结果表明,与山花13号相比,该突变体植株半矮化、枝较粗,种仁较大、种皮色泽较深,种子成分中含油量提高、粗蛋白含量下降。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了突变体叶片中赤霉素的含量,发现突变体赤霉素含量明显低于山花13号,用GA3处理突变体能够恢复突变体的株高。利用qRT-PCR方法分析赤霉素代谢和信号传导途径相关基因的转录水平,发现AhGA2ox、AhGA3ox、AhGA20ox、AhDella2、AhDella3等基因的表达均发生明显变化。以上结果表明,突变体内赤霉素合成途径关键酶基因的表达水平发生变化,使赤霉素合成能力下降,导致植株内赤霉素水平降低,从而出现矮化表型。     

赤霉素调控木质部发育的细胞学研究

以烟草为材料,通过转基因技术与外源施用激素,获得了超表达PtGA20ox、PtGA2ox1 及NtGA20ox RNAi 转基 因植株及不同激素处理野生型烟草植株,并对这些植株茎部木质部进行了石蜡切片及显微观察。结果表明:提高 内源赤霉素(GA)水平或外源施用GA3 能够明显促进烟草节间快速伸长,并促使木质部形成提前,木质部分化程度 提高;降低内源GA 水平或外源施用GA 合成抑制剂PAC 则延缓木质部的发育。研究结果证明了GA 在木质部发 育过程中起到正向调控作用,且存在依赖GA 浓度的调控机制;生长素IAA 对木质部发育的正向调控作用至少部 分是通过促进GA 的合成实现的。      

GA2-oxidase氧化酶基因的研究进展

GA2-oxidase氧化酶(GA2ox)是影响赤霉素合成和代谢的关键酶之一,其可以将具有生物活性的赤霉素或前体分解成没有生物活性的物质,在植物的生长发育中起着重要的作用。目前已经在拟南芥、杨树、水稻和葡萄等多种植物中克隆表达,其功能在不同物种之间也存在着差异。本研究主要从GA2ox基因的表达模式和基因功能进行阐述,重点阐述了GA2ox基因的时空表达情况,环境和激素对GA2ox基因的表达影响;GA2ox基因对植物的株高、花、果实和种子性状的改变,及与抗性的相互作用,更好地为了解GA2ox基因的作用机制提供参考。     

外源赤霉素诱导矮生山茶恨天高植株生长的转录组分析

对0 mg/L、800 mg/L赤霉素处理的矮生山茶恨天高叶片、茎段和茎尖进行了Illumina HiSeq高通量转录组测序,共获得476 635个Unigenes,其中181 115(38.00%)个Unigenes获得了注释;差异基因分析发现了43 624个差异基因,其中包括43 295个特异的和329个共同的差异基因;GO和KEGG富集分析结果显示,恨天高叶片增大、茎段伸长及茎尖生长与糖代谢、苯丙烷生物合成代谢相关;茎尖生长还与植物激素信号传导和二萜生物合成有关。通过赤霉素处理后恨天高叶片、茎段、茎尖转录组分析发现,茎尖组织中参与赤霉素生物合成的KAO、GA20ox、GA3ox和GA2ox基因表达量发生变化,赤霉素信号传导过程中DELLA蛋白调控以及赤霉素和生长素、细胞分裂素等其他激素间的互作促进恨天高植株生长。     

OsGA20ox2基因过量表达对水稻性状的影响

为研究水稻赤霉素20-氧化酶2(OsGA20ox2)基因的过量表达对水稻株高和生长发育的影响,通过RT-PCR扩增OsGA20ox2基因并构建该基因的过量表达载体pS12Q,采用农杆菌介导法遗传转化水稻,获得了高秆转基因植株.获得T0代的85株中,对其叶片基因组DNA进行Hyg基因扩增,发现其中2株为转基因植株且表现为高秆.分析其T2代表型,高秆植株与对照相比,株高增加9.41％ (P＜0.05);穗颈长增加15.62％ (P＜0.05);倒1节间长度增加8.46％(P＜0.05);穗长增加7.98％(P＜0.05);穗粒数增加6.8％(P＜0.05);分蘖数增加了12.5％ (P＜0.05);百粒重增加2.6％(P＜0.05);开花提前10天.这些性状导致高秆植株的产量增加,生育周期缩短.RT-PCR结果显示OsGA20ox2基因在高秆植株茎中的表达高于对照,促进了水稻茎的延伸.结果表明OsGA20ox2基因的过量表达影响了水稻的株高和生长发育.     

rolB-pttGA20ox双价基因在毛白杨中的表达及转化植株的形态特征

本研究对已整合外源rolB-pttGA20ox双价基因的毛白杨株系进行半定量RT-PCR检测,并对移栽后的转基因植株进行形态观测。结果表明:rolB和pttGA20ox基因的表达模式不同,rolB基因在不同器官中的表达强度为根>茎>叶,pttGA20ox基因的表达无组织特异性;rolB基因受外源生长素短时间诱导时表达丰度发生变化,pttGA20ox基因表达丰度不受外源生长素短时间诱导。对移栽温室后的转化植株的生长量分析结果表明,4个转化株系及对照的高生长增加量表现为RG-4>RG-1>RG-3>RG-2>CK。4个转化株系的株高和茎间长明显高于对照。转化株系与对照之间以及转化植株之间的形态特征出现了差异。