荧光素酶标记狂犬病病毒的反向遗传学

通过分子生物学技术克隆萤火虫荧光素酶(Luciferase)基因完整开放阅框后将其定向亚克隆入狂犬病病毒HEP-Flury株全长基因组中的假基因区域,经PCR、双酶切及测序证实构建了嵌有荧光素酶基因的狂犬病病毒全长cDNA感染性克隆。之后,利用反向遗传操作技术进行病毒拯救,抗核蛋白单抗直接免疫荧光染色结果显示,成功拯救了携荧光素酶基因的重组狂犬病病毒rHEP-luc株,RT-PCR证实插入的荧光素酶基因能够稳定遗传;荧光素酶活性分析显示,荧光素酶基因成功表达并具有良好生物学功能;这为应用活体成像技术研究荧光素酶标记狂犬病病毒在小鼠体内侵染移行规律奠定了基础。     

荧光素酶基因在家蚕细胞中的表达

本文将含有萤火虫荧光素酶基因的质粒pGL3,用脂质体转染方法转染家蚕BmN细胞,加入检测底物后,检测到了荧光素酶基因的表达产物——荧光发射,并进行了荧光扫描测试,测定了在波长562nm处的荧光发射动力学图谱。     

用于活体成像裸鼠肺癌肿瘤模型的建立

本研究构建1株能够稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞,并进行生物学特性鉴定及体内成瘤情况验证。将携带有萤火虫荧光素酶基因的pGL4.50质粒转入A549细胞中,利用G418一直加压筛选出能够表达荧光素酶的阳性细胞克隆,并对阳性细胞克隆进行稳定性和体外活体成像检测。测定A549-luc细胞和A549细胞的生长曲线、迁移、侵袭及细胞周期,确定转染前后细胞生物学特性变化。为检测A549-luc细胞在体内成瘤和发光情况,建立裸鼠皮下荷瘤模型并应用小动物活体成像系统观察。结果表明,通过G418一直加压筛选和荧光素酶活性检测,筛选出2株荧光素酶活性高的克隆Clone20和Clone28,并连续传至40代,每5代检测1次荧光素酶活性,最终保留荧光素酶活性和稳定性最高的Clone28,Clone28通过体外活体成像检测显示生物发光值与细胞数目呈正相关的线性关系(R2=0.994 8)。A549-luc细胞和A549细胞具有相似的生长特性、迁移和侵袭能力以及细胞周期。成功建立了裸鼠皮下荷瘤模型,其发光强度与肿瘤体积呈正相关的线性关系(R2=0.971 5)。本研究稳定表达荧光素酶的人肺癌细胞的构建并成功建立裸鼠皮下荷瘤模型,可通过活体生物成像系统动态监测肿瘤的变化。     

荧光素酶基因在转化烟草中的表达

来源于萤火虫的荧光素酶结构基因与花椰菜花叶病毒35SRNA启动子以及胭脂碱合成酶DNA3’末端结构相拼接,构成一融合基因.通过叶盘感染法将该融合基因引入烟草叶盘,把选择诱导培养基上形成的愈伤组织转到选择分化培养基后能很快分化出芽点,继而长成完整的再生植株.对再生植株提取物发光试验表明,外源基因已整合到烟草细胞的核基因组上,并能在烟草中表达.带有这种融合基因的重组质粒pBC341具有KpnI、SstI等单一的酶切位点,因而也可作为常规的基因载体.     

鸡IFN-β启动子荧光素酶报告载体的构建与活性检测

构建并鉴定鸡β干扰素(IFN-β)基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行转录活性分析.通过PCR方法从鸡基因组DNA中克隆鸡IFN-β基因启动子,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-basic载体上,构建鸡IFN-β基因启动子荧光素酶报告基因载体pChIFN-β-luc;用脂质体法将构建的报告基因载体瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,并设置空白对照组和poly(I:C)处理组,检测荧光素酶的活性.经PCR扩增出鸡IFN-β基因启动子序列,双酶切及测序鉴定各重组体构建正确;转染后检测,pChIFN-β-luc具有转录活性,并且在poly(I:C)的刺激下其荧光素酶活性显著升高.本试验为进一步研究鸡IFN-β基因转录调控机制奠定了基础.     

华南农业大学专家培育出绿色荧光猪 将有助于研制廉价药物

正目前,中国科学家最新培育出10只黑暗光线下发光的小猪,可释放出绿色荧光。这些小猪胚胎发育期注射了水母DNA,在较弱光线或者长波紫光线下,释放出独特的绿色荧光。专家指出,培育的10只小猪的寿命与正常猪一样,该项研究有助于研制适用于人类的廉价药物。科学家的最终目标是诱导良性基因到大型动物体内,形成较少成本,更有效的医疗效果,尤其是治疗一些遗传性疾病。莫西亚迪说:"对于血友病和血液中需要凝血酶的患者,我们可以从成本廉价的动物体内酶获取,而不需花费数百万美元。"     

A型鸭肝炎病毒微基因组的构建

正为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,中国农业科学院上海兽医所联合甘肃农业大学的科研人员采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了     

用于山羊痘病毒载体的强痘病毒启动子筛选

为提高重组山羊痘病毒(GPV)中外源基因的表达水平及筛选强转录效力的启动子,本研究选择桑灯蛾昆虫痘病毒42K启动子(42K)、痘病毒合成晚期441启动子(SL441)、痘病毒合成晚期454启动子(SL454)、牛痘病毒(VV)早晚期P7.5启动子(P7.5)、VV晚期P11启动子(P11)、VV H6启动子(H6)、VV合成早晚期启动子(E/L)及人工优化早晚期启动子(LEO)8种启动子,并在其下游插入萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因,分别构建了启动子效力检测重组质粒。并分别将其转染于预感染GPV的DF-1(鸡)、LT(绵羊)、BHK-21(仓鼠)和Vero(猴)4种动物源细胞中,以表达海肾荧光素酶(Rluc)的p RL-TK为内参质粒,24 h后检测荧光素酶活性。结果表明,在LT细胞中,SL441转录效力最强;在DF-1细胞中,LEO转录效力最强,为其他启动子的1.19~14.46倍;在Vero细胞中,H6和SL441的转录效力较强,达到其他启动子的1.21~11.24倍;在BHK-21中,H6启动子的转录效力也显著强于其它启动子。本实验最终确定了GPV在4种动物源细胞中转录效力强的启动子,该研究结果为进一步提高以GPV为载体疫苗的免疫效力奠定了基础。     

流感病毒将可“定位追踪”

记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉:我国科学家在国际上领先成功研制出携带荧光素酶的可示踪重组流感病毒IAV—luc,可以清晰地反应流感病毒对人体的感染情况,相当于给流感病毒安装了"定位追踪器"。该项成果日前在《自然·通讯》上在线发表。广州医科大学和中科院广州生物医药与健康研究院联合共建了呼吸疾病国家重点实验室,研制出携带荧光素酶的重组流感病毒     

猪THRSP基因5'侧翼区序列转录调控活性的鉴定

本研究旨在对猪THRSP基因5′调控区TP526序列进行转录调控活性的鉴定,以鉴别THRSP基因调控区的功能。提取猪耳组织基因组,利用PCR技术克隆THRSP基因5′调控区TP526序列,将其插入荧光素酶报告载体中(pGL3-Basic),构建猪THRSP基因5′调控区TP526序列调控的荧光素酶报告载体(pGL3-TP526/promot-er),经PCR鉴定后,转染293T细胞,利用双报告基因检测TP526序列的启动子活性。结果显示,pGL3-TP526/promoter调控的表达载体,其萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比(1.816 2±0.253 3)显著高于pGL3-Basic(0.126 7±0.020 3),呈高效表达(P<0.01)。THRSP基因5′调控区TP526序列具有启动子调控活性。     

猪圈内安装镜子可改善猪的生存环境

正美国农业部农业研究所的一项研究表明,当一头猪看到镜子的时候,它可能会帮助农业研究服务(ARS)的科学家改善猪舍的环境。研究家畜行为、其所受压力以及其他的健康和生产因素是动物科学家杰里米马查特-福德(marchantforde)和他在印第安纳州西部拉法叶畜牧行为研究部门同事们的工作内容。改善动物的生存环境可以减少其压     

猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及对天然中药提取物受体激动剂的筛选

本研究旨在构建猪食欲肽受体2(pOX2R)的真核表达载体,探究其对天然中药提取物的药理学活性。将成功构建的pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R和报告质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]分别瞬时转染HEK293T细胞,利用萤火虫荧光素酶报告基因检测法测定阳性细胞株在不同浓度激动剂Orexin A和Orexin B以及颉颃剂TCS作用下胞内cAMP水平。将目的质粒与报告质粒稳定共转染CHO-K1细胞,利用G418和潮霉素B进行抗性筛选,获得6株阳性细胞株和5株阴性细胞株。对具有促进食欲作用的18种天然中药材的36种提取物进行筛选,并用瞬时共转染了pcDNA3.1(+)-myc/pOX2R和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]的HEK293T细胞作为研究对象,对阳性提取物进行剂量效应分析。结果显示,Orexin A与Orexin B单独作用细胞时,可以使萤火虫荧光素酶的活性提高,呈明显的剂量效应关系,当与颉颃剂TCS联合作用时,TCS可以颉颃激动剂对受体的激活作用。通过优化药物刺激时间和二甲亚砜(DMSO)用量后,建立了以pOX2R为靶点的稳定、可靠的激动剂细胞筛选模型。经过初筛和复筛,得到了甘草水提物、白莲子和山药醇提物3种可以使阳性细胞荧光素酶表达量升高的提取物。提取物在一定浓度范围内可以刺激胞内荧光素酶的表达,呈剂量效应关系。以上结果为筛选出可以提高猪生产效率的先导化合物及相关药物研究提供参考依据。     

猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及对天然中药提取物受体激动剂的筛选

本研究旨在构建猪食欲肽受体2（pOX2R）的真核表达载体,探究其对天然中药提取物的药理学活性。将成功构建的pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和报告质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]分别瞬时转染HEK293T细胞,利用萤火虫荧光素酶报告基因检测法测定阳性细胞株在不同浓度激动剂Orexin A和Orexin B以及颉颃剂TCS作用下胞内cAMP水平。将目的质粒与报告质粒稳定共转染CHO-K1细胞,利用G418和潮霉素B进行抗性筛选,获得6株阳性细胞株和5株阴性细胞株。对具有促进食欲作用的18种天然中药材的36种提取物进行筛选,并用瞬时共转染了pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]的HEK293T细胞作为研究对象,对阳性提取物进行剂量效应分析。结果显示,Orexin A与Orexin B单独作用细胞时,可以使萤火虫荧光素酶的活性提高,呈明显的剂量效应关系,当与颉颃剂TCS联合作用时,TCS可以颉颃激动剂对受体的激活作用。通过优化药物刺激时间和二甲亚砜（DMSO）用量后,建立了以pOX2R为靶点的稳定、可靠的激动剂细胞筛选模型。经过初筛和复筛,得到了甘草水提物、白莲子和山药醇提物3种可以使阳性细胞荧光素酶表达量升高的提取物。提取物在一定浓度范围内可以刺激胞内荧光素酶的表达,呈剂量效应关系。以上结果为筛选出可以提高猪生产效率的先导化合物及相关药物研究提供参考依据。     

鸡黑素皮质素受体-4反向激动剂细胞筛选模型的建立

本试验旨在建立体外鸡黑素皮质素受体-4(cMC4R)反向激动剂的细胞筛选模型,为从中草药中筛选出能与cMC4R作用且存在活性的中药成分提供一些基础性的研究。将成功构建的cMC4R真核表达质粒cMC4R-pcDNA3.1(+)-myc与报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]按1:5的比例共转染到CHO-K1细胞,两周后经有限稀释法获得单克隆;将获得的单克隆分别用CRE激活剂Forskolin和MC4R激动剂NDP-MSH作用6 h,挑选萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的单克隆作为阳性细胞株;提取阳性细胞总RNA,RT-PCR检测阳性细胞内cMC4R基因、荧光素酶报告基因的转录水平;对MC4R激动剂NDP-MSH的终浓度、NDP-MSH孵育时间及溶剂DMSO的终浓度进行优化,应用Z'因子对筛选方法进行评估。结果显示,获得了5个单克隆(A2、F7、F8、F9、H10),其中单克隆A2的萤火虫荧光素酶的相对表达量最高,将其作为阳性细胞株;RT-PCR在预期位置扩增出大小分别为996和1 653 bp的两条目的条带;激动剂NDP-MSH终浓度为10^-9 mol/L、NDP-MSH孵育时间为8 h、溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z'因子为0.82。结果表明,本试验所建立的筛选方法可靠、稳定,细胞筛选模型可用于cMC4R反向激动剂的筛选,为进一步从中药中筛选出有效物质奠定了基础。     

优化病原的控制方法

<正>自1946年科学家首次发现抗生素生长促进剂(Antibiotic Growth Promotoers,AGPs)对动物生产具有促进作用以来,它在世界各地被广泛应用于动物生产中。AGPs是为控制病原菌而以亚治疗剂量加入饲料中的抗生素,从而可促进动物生长,降低发病率,提高饲料报酬。长期以来,抗生素在动物保健中的使用已经产生了抗这些药物的耐药菌。抗生素耐药基因从动物源性细菌向人源性细菌的转移较为常见。     

微量元素硒营养的研究与应用

微量元素硒（Se）于19世纪初被科学家发现,人们一直把它看成一种有毒物质,直到20世纪中叶,首次发现硒具有抗氧化功能,可防止犊牛和羔羊白肌病,其营养作用才开始引起重视。迄今为止,微量元素硒已在畜牧业生产中得到广泛应用。1 硒在动物体内的存在形式及其生物学功能     

微量元素硒在动物营养中的研究进展

微量元素硒（Se）于19世纪初被科学家发现，人们一直把它看成一种有毒物质，直到20世纪中叶，首次发现硒具有抗氧化功能，可防止犊牛和羔羊白肌病，其营养作用才开始引起重视，被认为是动物必需的矿物质元素。迄今为止，微量元素硒已在畜牧业生产中得到广泛应用。     

表达荧光素酶重组RABV rERA-Luc株的构建及其生物学特性的研究

为建立一种能够实现病毒活体示踪的狂犬病病毒(RABV),以有效地研究RABV的侵染机制,本研究基于重组RABV rERA载体,利用反向遗传技术构建了包含rERA全长基因组cDNA及萤火虫荧光素酶(Luc)基因的重组质粒,并经Pme Ⅰ酶切鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒共转染鼠肾成纤维细胞(BSR),4 d后收集上清液,...     

互助县创建非洲猪瘟无疫小区的探索与实践

<正>建设无疫小区,是实现动物疫病区域化管理的重要举措,是预防、控制、净化疫病的有效手段,也是国际通行的做法。本文以互助县青海泰和源农牧科技有限公司成功创建非洲猪瘟无疫小区为例,归纳总结了全县无疫小区创建的优势、创建的过程、取得的成效以及今后工作的重点。并以此形成的技术规范、管理制度、安全体系建设等,指导全县养猪场推广了其创建技术、借鉴了其管理制度,全县规模养殖场疫病综合防控水平明显提升,至今未发生非洲猪瘟等重大动物疫情,取得了良好的经济效益和社会效益,为青海省其他地区无非洲猪瘟小区创建提供了可参考的现实案例。     

科学家发现永葆青春基因:有助愈合伤口

据报道,科学家发现了"青春之泉"基因。一直以来,专家对动物幼崽比成年动物从伤害中更快恢复的原因感到困惑。Lin28a基因在未出生婴儿体内异常活跃,但随着年龄增长,其数量越来越少。在对老鼠进行的试验中,它加快治愈伤口的速度,同时加快身上软毛的重新生长。它还在耳朵受伤后帮助修复里面的组织。通