PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝·反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,...     

鸡马立克氏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。     

兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease, RHD）是一种具有高度传染性的疾病,严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法,试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增,得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列,并将其克隆到pMD19 T载体中作为标准品建立标准曲线;在扩增区域内设计一对简并引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,优化反应条件,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果表明：该方法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101 copies,只能特异性扩增RHDV,pGM19 T EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性,具有良好的特异性和重复性;同时用此方法对人工感染家兔的内脏分别进行检测,结果表明SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR能快速检测到不同脏器中的兔病毒性出血症病毒RNA含量,可用于临床兔瘟病毒的检测。     

Ⅱ型猪圆环病毒SYBR GreenⅠ模式实时定量PCR检测方法的建立

登录GenBank下载猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)的全基因组序列,根据其保守区域,设计1对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立该模式的实时定量PCR检测方法,构建了检测PCV-2型的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×102～1.0×107拷贝·μL-1浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999。该方法用于猪圆环病毒2型的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪圆环病毒2型的快速检测。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

H9亚型鸭源禽流感病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

针对H9亚型禽流感HA基因保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的荧光定量RT-PCR(real-ti me RT-PCR,RRT-PCR),最低检测限为8.33×102拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.83±0.22)℃,组内变异系数为0.52%~1.48%,组间变异系数为0.71%~2.21%,可重复性好;对H5亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭源禽1型副粘病毒无扩增;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4.5 h。     

人双埃克病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能快速、简便、灵敏地检测人双埃克病毒(Human Parechovirus,HPeV)SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank发表的人双埃克病毒8个基因型的参考毒株全序列,针对5′端非编码区保守序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增此靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,经过优化反应条件,建立标准曲线和融解曲线,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价;检测临床粪便样品共156份,并与常规套式RT-PCR检测结果进行比较。结果显示,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeVs的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

禽网状内皮组织增殖病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

为了探究禽网状内皮组织增殖病的快速检测方法,根据禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)LTR和gag基因的保守区域各设计并合成一对引物,建立检测插入感染与全病毒感染的SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法(Real-time PCR)。以pMD-LTR,pMD-gag重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果表明:该方法线性关系良好;敏感性能检测到10拷贝标准品;能特异性检测REV样品,不与其它禽相关病原发生交叉反应;板内、板间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法对人工感染REV的鸡的心、肝、脾、肺、肾、盲肠扁桃体、腺胃和法氏囊进行初步检测,结果显示法式囊中的含量最高。     

木尔坦棉花曲叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法

【目的】木尔坦棉花曲叶病毒Cotton Leaf Curl Multan Virus（CLCuMV）是为害锦葵科植物的重要双生病毒之一,本研究的目的是建立CLCuMV定量检测方法,为进一步研究其在寄主植物内的增殖动态、在介体昆虫内循环和其与寄主、介体间互作机制提供技术手段.【方法】 以纯化的含CLCuMV基因组的质粒为模板,利用 SYBR Green I 荧光定量 PCR对不同浓度的质粒样品进行CLCuMV扩增,制作标准曲线.依照建立的标准曲线,计算烟粉虱Bemisia tabaci及朱槿Hibiscus rosa-sinensis中CLCuMV的含量.【结果和结论】 该定量检测法可检测到低浓度（5.2×10¹ μL^-1)的CLCuMV,其灵敏度是常规PCR的10倍,可被用于在寄主植物和介体昆虫体内CLCuMV的定量检测.     

实时荧光定量PCR法检测草莓镶脉病毒

为了建立一种特异、灵敏、快速检测草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,根据已有的检测SVBV的引物信息,合成引物,对不同草莓品种进行PCR扩增。经过克隆、测序及序列比对得到了感染SVBV的阳性植株,利用此植株PCR扩增产物构建重组质粒作为标准品,优化了PCR反应体系,标准曲线的循环阈值（Ct值）与模板浓度有良好的线性关系（R2=0.999 1）;进行了灵敏度和重复性试验,敏感性可达到101拷贝·μL-1,约为普通PCR的1 000倍,重复性好;并与常规PCR方法进行了比较,成功建立了检测SVBV的实时荧光定量PCR法。用该方法检测了部分草莓品种的DNA样品,结果表明,大部分植株都带有SVBV。该方法具有很高的灵敏性和重复性,可用来快速检测草莓植株是否感染SVBV。     

非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P72基因,建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0～1.0×10~9 copies·μL~(-1)的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL~(-1);对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL.结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测.     

基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术

生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green I实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的BVDV 5'端非编码区(5'UTR)核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR方法。【结果】建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102¹08copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5%,具有重复性好的特点。【结果】成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。