天然黄茧品种彩茧1号在云南省实验室的鉴定试验

为了解天然黄茧品种彩茧1号的性状及对云南地区的适应性,于2010年春蚕期和2011年春、秋蚕期以云南省大面积推广应用的菁松×皓月为对照品种,进行了实验室比较试验,结果表明:彩茧1号与对照品种相比,幼虫期发育快而整齐,其5龄经过与全龄经过均缩短了9～24 h;体质强健,秋季更好,虫蛹率提高2.44％;万头收茧量提高6.64％～19.67％;春季的万头茧层量低8.83％ ～ 11.75％,而秋季提高4.03％;反映茧丝质的茧丝长、出丝率分别比对照品种少118 m、3.14％;解舒率高,达到了78.3％以上,3期平均比对照品种提高0.8％;清洁与对照品种相当,而洁净比对照品种提高0.9分.试验结果为新品种彩茧1号的推广提供了依据.     

家蚕Poly(A)结合蛋白基因BmPABP的克隆及序列与功能分析

Poly(A)结合蛋白[Poly(A)-binding protein,PABP]是广泛存在于真核生物细胞内的一类高保守性蛋白,通过与Poly(A)的结合形成翻译起始复合物调节mRNA的稳定性和翻译效率。利用RT-PCR方法克隆了家蚕Poly(A)结合蛋白基因Bm-PABP,该基因含有4个外显子,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为1 812 bp,编码603个氨基酸,具有4个典型的RNA识别模体(RNA recognization motif,RRM)和1个保守的C末端结构域。基因芯片数据分析显示,BmPABP在家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄第4天至化蛾阶段具有高水平的转录表达。构建基于家蚕Actin4启动子的瞬时转染载体pSLA4-Bm-PABP,将其与携带有荧光素酶报告基因的pSLA4-LUC质粒分别按1∶1和2∶1的摩尔比混合后共转染昆虫Sf9细胞,于转染后72 h检测荧光素酶活性,结果显示荧光素酶的活性较对照分别提高了11.9倍和7.5倍。研究结果初步证实了BmPABP具有促进目的基因表达的功能,同时提示利用BmPABP有望提高外源基因在转基因家蚕中的表达水平,可应用于家蚕生物反应器研究。     

猪CFL2基因cDNA的克隆与序列分析

动物肌肉是人们蛋白质的主要来源之一,其基本组成单位是肌纤维.近年来,猪肉品质已成为猪遗传育种学家研究的热点和难点问题.研究表明,肌肉的组成结构和肌纤维的组织学特性与肉品品质,特别是食用品质性状密切相关.肌动蛋白是构成肌节细肌丝和细胞骨架的主要成分,并参与了生物体内一系列重要的生理活动,如肌肉收缩、细胞运动、胞质分裂等.这些过程的发生除了需要肌动蛋白以外,还需要一些与之结合的调节蛋白参与,cofilin就是其中一类低分子量的肌动蛋白结合蛋白,广泛分布于从酵母到哺乳类的生物体内.哺乳动物都表达两种cofilin基因：CFL1和CFL2,其中CFL2主要在骨骼肌和心肌表达,被认为是肌肉组织肌动蛋白装配的调节器,对正常肌肉功能和肌肉再生起着重要的作用.但目前对其研究还比较少,其在骨骼肌中的功能性作用尚未证实.本试验试图通过对猪肌肉组织CFL2基因结构及其蛋白功能的研究,进一步了解它在骨骼肌细胞生长发育中的作用,以便为后续多态性研究及今后猪的分子遗传育种提供理论基础.     

家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的克隆及序列分析与融合表达

异三聚体G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到细胞内的重要分子,参与生物体内广泛的信号转导途径。采用生物信息学方法和RT-PCR、RACE技术克隆了家蚕G蛋白α亚基基因BmGα12的全长cDNA序列,该序列全长1374 bp,开放阅读框(ORF)1 128 bp,编码375个氨基酸。将构建的表达载体pET-41b(+)-Gα12转化E.coli BL21宿主菌进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测显示,BmGα12可在E.coli BL21中高效表达,GST-BmGα12融合蛋白主要以包涵体形式存在,其分子质量约71 kD。系统进化分析显示BmGα12与大鼠和人Gα12/Gα13的亲缘关系较近,初步推测BmGα12介导的信号传导同样在细胞生长、胚胎发育中起重要作用。     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

口蹄疫3ABC蛋白基因的克隆与序列分析的研究

采用RT—PCR扩增FMDV的3ABC蛋白DNA，将其与pUCm—T栽体连接，构建pUCm—3ABC重组质粒，序列分析表明，pUCm—3ABC重组质粒的插入DNA与多种血清型FMDV的相同DNA区段有较高的同源性，提示可进一步用pUCm—3ABC重组质粒研究FMDV3ABC蛋白的表达抗原。     

四种禽类Sox8基因部分cDNA序列的克隆及其序列分析

应用RT—PCR法扩增了鸭、孔雀、榛鸡和鹧鸪的Sox8基因的部分cDNA序列并测序，计算机模拟预测了其氨基酸序列，并将所得的序列与GenBank上发表的家鸡的相应序列进行同源性比较。结果表明：5个物种的核苷酸序列同源性可达96％以上。。     

牛朊蛋白(bPrPc)基因的克隆和序列分析

分别从9头牛(3头牦牛、3头荷斯坦牛和3头秦川黄牛)全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrP^c)基因，并克隆到pMD18-T载体。序列分析表明所克隆的牛PrP。的片段大小为795bp，包含了牛朊蛋白基因的完整编码区序列，为含单一外显子的完整开放阅读框，与国内外报道的已知序列基本相同。本次所报道的牛PrP(bPrP^c)基因含6个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln／Arg或九肽Pro-Gin／His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp／Arg-Gly-Gin。这些bPrPC基因序列相比较，其核苷酸和氨基酸同源性分别在99．0％～100．0％和99．2％～100．0％之间。在整个18个碱基替换中，多数替换是保守的，为同义突变，仅有5个替换引起氨基酸突变，分别为HN200302的W60R、HN200303的S154N、MN200301的A129V、NN200302的Q234R和NN200303的Q94R突变。发现牦牛朊粒基因在126(A-G)、234(G-A)和678(T-C)位的特征性核苷酸替换，但均为同义码替换。     

藏猪r-干扰素基因cDNA的克隆及序列分析

将藏猪外周血淋巴细胞进行体外培养，在Con A 的刺激下培养70h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT-PCR技术扩增藏猪淋巴细胞r-干扰素cDNA(TPr-INF)，并克隆到pMD-T载体上，进行测序。结果显示：克隆的TPr-INF cDNA全长为545个碱基，ORF为501个碱基，编码166个氨基酸，分子量为19．4ku，等电点为10．29。此cDNA与牛、马的r-INF同源性分别为86％和81％，与猪的r-INF同源性为100％，证明克隆到了藏猪的r-干扰素cDNA。     

家蚕细胞色素P450基因CYP6AE2的分子克隆与序列分析

为了在分子水平上研究家蚕(Bom byx mori)细胞色素P450基因的特性,更好地探讨该基因与家蚕抗性的相关机制,依据已有的家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,选择与抗性相关的6家族中含有预测基因数量最多的CYP6AE亚家族的1条序列,并设计1对引物,用RT-PCR方法克隆了家蚕细胞色素P450家族基因CYP6AE2(Gen-Bank登陆号:EF415296)。该基因的ORF为1 572 bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为60.2 kD,等电点为8.50。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,结果表明该基因只有1个内含子;与已知的同亚家族基因CYP6AE1(欧洲防风草结网毛虫Depressaria pastinacella)、CYP6AE12(棉铃虫Helicoverpa armigera)编码的氨基酸序列比对,同源性同为53%。     

一个新的家蚕BmLITAF基因的电子克隆及序列分析

在对家蚕蛹cDNA文库的测序中发现了脂多糖诱导肿瘤坏死因子α的转录激活因子(lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-α factor,LITAF)的EST序列(GenBank登录号AADK01016184)。经过比对发现BmLI-TAF全长为981 bp,由97 bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、390 bp的开放读码框(ORF)和494 bp的3′端非翻译区序列(3′UTR)组成。用电子克隆方法对BmLITAF进行基因结构分析发现,此基因由3个外显子和2个内含子组成,编码129个氨基酸。对BmLITAF蛋白进行疏水性、跨膜结构和信号肽分析的结果显示,BmLITAF具有跨膜结构域。根据BmLITAF的电子克隆序列由家蚕基因组PCR扩增获得BmLITAF基因,将其克隆到pGEM-T-easy载体中,测序验证与电子克隆结果一致。     

家蚕绿色茧品种G_1的茧色性状遗传及不同茧色蚕体组织的黄酮类化合物含量分析

为了探究绿茧系家蚕品种的茧色性状遗传规律,以家蚕绿茧品种G1和白茧品种C108为亲本,配制正反交F1及其自交F2和回交代等多种群体材料,茧色分离调查结果显示:F1为浅绿色茧;自交F2呈现白色茧∶浅绿色茧∶绿色茧=1∶2∶1的分离比;回交后代(C108×G1)×G1、G1×(G1×C108)均呈现绿色茧∶浅绿色茧=1∶1的分离比,而C108×(G1×C108)呈现白色茧∶浅绿色茧=1∶1的分离比。此结果说明家蚕品种G1的绿茧性状对白茧性状为不完全显性遗传。家蚕绿茧系的显色物质为黄酮类化合物,分析不同茧色蚕体组织中的黄酮类化合物含量是研究色素代谢与绿色茧呈色机制的重要途径之一。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法,测定亲本绿茧品种G1、白茧品种C108和(G1×C108)F1的幼虫中肠、血液、丝腺组织在整个5龄期的黄酮类化合物含量以及茧层中的黄酮类化合物含量,结果显示:3种茧色个体的中肠组织的黄酮类化合物含量无明显差异,推测其合成黄酮类化合物的能力相当;中肠组织与血液中的黄酮类化合物含量与茧色没有明显关系;丝腺组织和茧层中黄酮类化合物含量以G1最高,(G1×C108)F1居中,C108最低。此结果说明绿茧色的深浅与丝腺和茧层中的黄酮类化合物含量表现出良好的一致性。     

家蚕黄茧候选基因Cameo1和Cameo2在不同茧色品种的表达差异与功能分析

外层黄茧C基因是家蚕对体内类胡萝卜素选择性吸收的关键基因之一。以13个黄红茧系品种(包括1个限性黄茧品种)、7个绿茧系品种、1个白色茧品种为材料,采用RT-PCR方法,检测和分析C基因的2个候选基因Cameo1和Cameo2在4龄和5龄幼虫不同组织的表达差异。结果表明,丝腺对黄茧色素类胡萝卜素的吸收不依赖于Cameo1基因的表达,Cameo1基因表达没有茧色和性别特异性,其蛋白产物可能没有直接参与黄茧色素吸收,而是作为B族清道夫受体家族(SCRB)成员在家蚕免疫系统中发挥作用;虽然Cameo2基因的蛋白产物介导了中肠中的黄色茧主要色素成分叶黄素的主动运输方式,但Came-o2基因不只是在家蚕黄色茧品种中肠的特异表达基因,Cameo2基因在家蚕中肠以外的组织表达特异性与这些组织的黄茧色素积累密切关联,生殖腺可能是比中肠和丝腺更加重要的Cameo2基因表达和作用的组织。     

家蚕黄茧近等基因系SSH文库的构建及部分EST序列分析

以家蚕黄茧品系KY(YYCC)和白茧品系C108(+Y+Y+C+C)组配黄茧(C)近等基因系。挑取回交11代的黄茧(C)近等基因系群体中的黄血个体的黄色和浅黄色中部丝腺作为实验材料,构建家蚕黄茧近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对SSHcDNA文库中随机挑选的104个阳性克隆测序和聚类拼接,得到15个假定基因(contig)、25个已知功能基因(unigenes)和5个未知功能基因(unknown)。获得的表达序列标签(EST)经Blast比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内能量代谢、基因转录、信号传导、物质转运、细胞生长分裂、细胞结构形成、蛋白质合成与降解、核酸及蛋白质加工、机体防御等诸多生物学过程。分析结果可作为深入研究家蚕茧着色分子机制的基础信息。     

具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因的克隆及序列结构与表达研究

丙酮酸脱氢酶(PDH)是丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中的前件酶,参与生成柠檬酸循环(TCA)的起始物乙酰辅酶A,决定生物体内营养成分的分配。利用电子克隆、RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了与果蝇lethal(1)G0334基因类似的具有丙酮酸脱氢酶功能的家蚕Bm-l(1)基因。Bm-l(1)基因的cDNA全长为1 630 bp,由1 200 bp的完整ORF序列、186 bp的5'-UTR和207 bp的3'-UTR组成,含8个外显子和7个内含子,编码蛋白为399个氨基酸残基,分子质量43.93kD,pI 8.07。Bm-l(1)基因编码蛋白的69-365氨基酸残基为E1-dh结构域,该结构域为硫胺素焦磷酸依赖性脱氢酶所特有。蛋白质二级结构预测结果表明α螺旋占28.8%,β折叠占12.0%。采用Clustal W进行多序列比对发现,Bm-l(1)基因编码蛋白与赤拟谷盗等昆虫的PDH具有63%以上的序列相似性,且保守区域高度一致。Bm-l(1)基因mRNA在家蚕整个卵期、幼虫期、蛹期和刚羽化的成虫中,以及5龄3 d幼虫的头部、丝腺、生殖腺、脂肪体、中肠和血液6种组织中都有较高的转录水平,且存在较小的组织差异性。     

家蚕HSP70基因的电子克隆与序列分析

热休克蛋白70(HSP70)广泛分布于生物体中,在蛋白转运、耐热性、细胞保护等方面起着重要作用.本研究以黑腹果蝇的一个HSP70氨基酸序列与家蚕基因组预测的基因库进行tBlastn检索,共获得了多个可能的家蚕HSP70基因,我们对编号为BGIBMGA002381进行了电子克隆.BGIBMGA002381基因的编码区序列...     

家蚕膜蛋白基因(BmTmC27)的序列分析及组织特异性和原核表达

从家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条家蚕膜蛋白基因序列,通过编码氨基酸序列的同源性比对表明其可能是家蚕的未知功能序列,命名为BmTmC27(GenBank登录号:DY231073.1)。生物信息学分析结果表明该基因全长833 bp,由558 bp的开放阅读框、102 bp的5'端非翻译区和173 bp的3'端非翻译区组成,编码蛋白由185个氨基酸组成且含有4个跨膜区,预测蛋白分子质量为20.94 kD,等电点为7.38。将该基因片段与BmNPV的polh基因连接后克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核融合表达载体pGEX-4T-1-polh-BmTmC27,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白以包涵体形式在E.coli BL21(DE3)中表达。利用多角体蛋白可溶于碱性环境的性质,采用调节pH值的方法纯化融合表达的重组蛋白GST-Polh-BmT-mC27,然后经TEV酶消化获得BmTmC27蛋白。荧光定量PCR分析BmTmC27在家蚕5龄幼虫不同组织中的表达存在明显差异,其中在脂肪体、中肠和气管中的转录水平较高。利用GST沉降技术研究了BmTmC27的互作蛋白,与对照组相比,发现了4条特异性互作蛋白条带。研究结果有助于进一步探究BmTmC27的生物学功能,也为膜蛋白的表达和纯化提供了一种新方法。     

家蚕蛋白激酶C受体基因( Bmrack )的克隆及序列分析

蛋白激酶C受体蛋白(RACK)除作为细胞内蛋白激酶C的受体之外,还作为细胞内重要的支架蛋白调节细胞功能。应用生物信息学方法对家蚕RACK蛋白的编码基因Bmrack进行电子克隆,获得了1224 bp的重组序列,基因编码区长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白分子质量为36.04 kD,等电点为8.07。从家蚕幼虫脂肪体基因组DNA中PCR克隆了Bmrack基因,序列总长为2 122 bp,含有4个内含子和5个外显子,通过家蚕WGS比对,结果与其中5条序列的一致性为99%,且修复了其中8个缺口。聚类分析表明RACK蛋白的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中非常保守。     

家蚕精巢特异性蛋白激酶基因Bm-TSSK的克隆及序列与表达分析

睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)首先在哺乳动物中被发现,是一类在精子发生过程起重要作用的蛋白激酶。通过EST同源筛选方法,用人(Homo sapiens)的TSSK2、TSSK4、TSSK6基因cDNA和小鼠(Mus musculus)的TSSK1、TSSK3、TSSK5基因cDNA为探针在GenBank家蚕EST数据库中搜索同源基因,通过在家蚕基因组数据库的同源性检索以及电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了Bm-TSSK基因完整的开放阅读框(ORF),序列分析及同源性比对表明:Bm-TSSK序列长1 402 bp,ORF为1 041 bp,没有内含子,推测编码346个氨基酸残基,在编码氨基酸序列20～284区域有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域;该基因推导的氨基酸序列在进化上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、熊蜂(Bombus terrestris)、顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的亲缘关系较近,相似度分别为81%、86%和85%。基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,推测Bm-TSSK参与了家蚕精子的形成。