靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

牛SREBP1基因shRNA序列的筛选及其腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区（coding sequence,CDS）序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并在293A细胞包装扩繁得到高滴度腺病毒,GFP标记法测定病毒滴度。最后将病毒侵染牛前体脂肪细胞,实时荧光定量法（qRT-PCR）检测干扰效率。【结果】筛选出靶向牛SREBP1基因干扰效率为87.4%的shRNA-1053。构建了pAd-1053和阴性对照pAd-NC重组腺病毒载体并包装得到Ad-1053和Ad-NC高滴度病毒,测定得到的病毒滴度分别为7×108 GFU•mL-1和9×108 GFU•mL-1。Ad-1053和Ad-NC分别侵染牛前体脂肪细胞,qRT-PCR检测结果显示Ad-1053可显著降低SREBP1基因的mRNA 水平（干扰率＞85%）,而Ad-NC对SREBP1基因表达无明显影响。【结论】成功筛选得到靶向干扰牛SREBP1基因的有效shRNA,并包装扩繁获得相应的高滴度重组病毒。     

质粒介导的RNAi沉默mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性

通过pSilencer 2.1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达,可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段,定向克隆到pSilencer 2.1-U6neo质粒中,成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体,电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况,流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能,MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。结果显示,构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后,HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%(P0.01),P-糖蛋白的表达量降低了48.27%(P0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由10.8%±0.58%升高至73.56%±1.37%;转染细胞对姜黄素敏感性明显增强,IC50由(24.10±0.83)μmol/L降至(5.10±0.14)μmol/L;耐药相对逆转率为84.74%±1.86%,与HT9细胞相比,经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达,能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

抑制14-3-3ζ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ζ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒。[方法]设计靶向14-3-3ζ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果。从psiRNA质粒上扩增H1-si-ζ基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlu1酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达。[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装。[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ζ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3ζ相关的体内、外研究提供了试验基础。     

抑制14-3-3ξ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ξ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒.[方法]设计靶向14-3-3ξ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果.从psiRNA质粒上扩增H1-si￡基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlul酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达.[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装.[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ξ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3￡相关的体内、外研究提供了试验基础.     

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1基因敲低人肺癌细胞A549构建及其对线粒体功能影响

目的 建立脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1(APE1)基因敲低人肺癌细胞A549,并初步观察线粒体功能变化.方法 APE1基因shRNA序列与pSIREN-RetroQ慢病毒载体经酶切连接重组体(pSIREN-RetroQ-shAPE1),再与病毒包装质粒共转染293T细胞;收集病毒液并感染A549细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株A549shAPE1.免疫印迹法检测稳定细胞株中APE1干扰效率.用双氧水处理A549 shCotrol和A549 shAPE1细胞24 h,分析细胞内ATP及活性氧(ROS)变化.结果 经PCR和测序鉴定成功构建重组慢病毒载体pSIREN-RetroQ-sh APE1,免疫印迹法证实A549 shControl和A549 shAPE1稳定细胞株构建成功;双氧水处理后,A549shAPE1细胞中ATP活性明显低于A549shControl细胞(P＜0.05),而ROS明显增加(P＜0.01).结论 APE1干扰可影响肺癌细胞中线粒体功能.     

7个shRNA分子对绵羊BMPR-1B基因的干扰作用分析

为获得有效干扰绵羊BMPR-1B基因的shRNA干扰分子,从绵羊卵巢组织中扩增了1 515 bp BMPR-1B基因全长编码区cDNA序列,添加HA标签序列后,插入Plex-mcs慢病毒质粒,构建Plex-BMPR-1B慢病毒表达载体,转染HEK293细胞,并与2个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,用获得的重组慢病毒感染HEK293细胞;同时,将7个干扰分子与Pll-LentiLox 3.7载体重组,并与3个包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,获得干扰分子的重组病毒颗粒。最后用干扰分子重组的病毒颗粒感染整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞,进行qRT-PCR和Western blot检测。结果显示:重组BMPR-1B蛋白质在稳定整合Plex-BMPR-1B的HEK293细胞系中获得了表达;研究中设计的7个shRNA分子能抑制绵羊BMPR-1B基因表达水平68.30%～99.86%,其中PLL-BMPR-1B-1306和PLL-BMPR-1B-1475干扰分子的干扰效果最好。     

慢病毒介导的靶向Vegfr2 shRNA干扰对血管内皮细胞生长的影响

为评价慢病毒介导的Vegfr2 shRNA干扰对内皮细胞中VEGFR2的沉默效应,及对血管内皮细胞生长的影响,构建靶向大鼠Vegfr2基因的shRNA干扰慢病毒载体,并感染血管内皮细胞。通过RT-PCR和Western blot检测Vegfr2的mRNA及蛋白表达水平,评价所建慢病毒载体对靶基因的干扰效率;通过BrdU增殖试验、划痕试验和基质胶-管形成试验,评价对血管内皮细胞生长、迁移的影响。结果表明:靶向Vegfr2基因的重组慢病毒,能显著抑制大鼠血管内皮细胞中Vegfr2的mRNA和蛋白表达,抑制率均达70%。对内皮细胞的增殖、迁移及管形成有极显著抑制作用。这一研究提示慢病毒介导的靶向RNA干扰能有效沉默血管内皮细胞中VEGFR2的表达,显著抑制内皮细胞的生长和体外管样结构的生成。     

A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体的构建

以A型流感病毒NP基因为靶标,设计并合成了3对编码发夹状siRNA寡聚核苷酸。将合成的序列互补的寡聚核苷酸退火形成双链,克隆至pSilencer 1.0-U6载体中,并转化DH5a菌株,氨苄抗性筛选阳性菌落,扩大培养后,提取质粒进行酶切鉴定,并进行测序分析。结果显示,酶切后得到预期长度的DNA片段;插入序列插入的位置与设计完全一致,无碱基缺失或突变。表明A型流感病毒NP基因小干涉RNA表达载体构建成功。     

慢病毒载体介导的APP695过表达SH-SY5Y细胞系的构建和鉴定

目的通过构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,用以建立可以稳定过表达APP695蛋白的SH-SY5YAPP695细胞株。方法利用PCR方法扩增目的基因片段APP695,并构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,鉴定后将构建好的载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,并以最适感染复数感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,筛选稳转SH-SY5Y-APP695细胞株并用PCR和Western blot鉴定稳转株细胞APP695表达。结果对pLVX-APP695-PGK-Puro载体进行酶切鉴定及DNA测序证明构建过表达APP695的重组慢病毒载体成功,PCR和Western blot显示构建的SH-SY5Y细胞稳转株成功。结论成功构建APP695基因的慢病毒载体并成功构建了SH-SY5Y-APP695细胞株,该载体可在SH-SY5Y细胞株中高水平表达APP695。     

慢病毒法建立稳定表达HPV-16 E6癌蛋白的肺癌细胞株

目的方法结果结论（HPV）-16 E6DNA HPV-16 E6（PLIG）（PLIG-E6）293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用重组技术将基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体中,获得重组慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定正确后,与慢病毒包装载体一起转染细胞,收集病毒液,测定滴度后,感染肺癌细胞株。经筛选培养周后,提取细胞基因组和蛋白,分别用和方法分析细胞中和蛋白的表达。双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功;感染慢病毒液的细胞中可检测出和蛋白表达。用慢病毒法成功构建稳定高表达癌蛋白的肺癌细胞株。     

苹果周期蛋白依赖性蛋白激酶亚基基因MdCKS表达载体的构建

根据GenBank上与周期蛋白依赖性蛋白激酶基因相关序列,从苹果MdCKS基因编码区设计带有XbaI和SalI酶切位点的引物。以富士MdCKS基因的eDNA为模板将PCR扩增片段连接到pMD18-TSim-pieVector上,测序正确后,再连接到植物表达载体pBII21上,经过抗性筛选和测序验证,成功构建了MdCKS基因表达载体。并通过电击转化法导入农杆菌LBA4404,以备将来用于番茄转化。     

玉米特异表达启动子驱动下结核esat-6抗原基因植物表达载体的构建及鉴定

以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Esat-6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上,将globulin-1-Esat6联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中,构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GEsat-6,电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中.通过对pC1300GEsat-6质粒酶切鉴定和测序分析表明克隆的Esat-6与预期相符,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合.     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。     

牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建

按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列,通过PCR合成BeL1-2-3,经双酶切后克隆入pED质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至E.coliBL-2(1 DE3),获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后,可表达出可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。     

高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。