响应面法优化酶法提取大鲵皮胶原蛋白工艺

为了优化人工养殖大鲵(Andrias davidianus Blanchard)皮中胶原蛋白的提取工艺, 以加酶量、液料比和酶解时间为试验因素, 胶原蛋白提取率为响应值, 采用Box-Behnken设计进行试验。通过响应面法考察了3个因素对胶原蛋白提取率的影响, 建立了胶原蛋白提取率的二次多项式回归模型, 并对提取工艺进行了优化。试验结果表明, 3个因素对鲵皮中胶原蛋白提取率的影响大小次序为: 液料比>酶解时间>加酶量; 交互项中“液料比-酶解时间”项对提取率影响显著, 其他交互项对提取率影响不显著。为满足实际需要, 对模型预测得到的大鲵皮胶原蛋白最优提取工艺稍做调整, 具体参数为: 加酶量16.5%、液料比15 mL/g、酶解时间29 h。此条件下, 大鲵皮胶原蛋白提取率可达到66.99%, 与模型理论预测值(67.83%)较为一致。

     

傀儡湖鲢、鳙的生长特性及渔业利用

对江苏昆山市傀儡湖冬季围网捕捞到的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、鱅(Aristichthys mobilis)的生长状况进行了测量分析。结果表明:在保水渔业模式下,鲢、鳙的生长速度慢于传统放养模式;鲢的全长、体重生长方程分别为:Lt=73.12×[1-e-0.35(t+0.86)];Wt=7.74×[1-e-0.35(t+0.86)]2.9031,鳙的全长、体重生长方程分别为:Lt=94.35×[1-e-0.25(t+0.73)];Wt=15.26×[1-e-0.25(t+0.73)]2.7372;鲢体重生长速度以1-3龄较高,生长拐点为2.2龄,鳙体重生长速度以1-4龄较高,生长拐点为3.3龄。为了使鲢、鳙放养的除藻效应和经济效益达到最优,傀儡湖渔业利用鲢应以4龄为起捕年龄,鳙应以5龄为起捕年龄。     

芦苇秆浸出液对铜绿微囊藻抑制作用的研究

研究了芦苇浸出液对铜绿微囊藻(Microcystis aetuginosa)生长的抑制作用。结果表明,不同部位的芦苇浸出液对铜绿微囊藻的生长抑制有差异,抑制效果为:根浸出液>穗浸出液>秆浸出液。新鲜烘干的芦苇秆和干燥的芦苇秆抑藻效果相当,粉末状芦苇秆抑藻效果不明显;未过滤的芦苇秆浸出液与灭菌、过滤的浸出液对铜绿微囊藻的生长的抑制作用差距不大;每升水浸泡40 g芦苇秆,15 d时浸出液的抑藻效果最好,培养10 d后的抑制率达67.8%;同时藻细胞的生物量和叶绿素a含量显著降低,SOD酶活性呈先升高后下降趋势,藻细胞出现聚集现象。     

高效液相色谱法测定兰州鲇等鱼类肌苷酸的含量

为全面了解兰州鲇(Silurus lanzhouensis)肌肉品质,建立了兰州鲇肌肉中肌苷酸含量的高效液相色谱测定方法。样品经5%pH 6.5～6.8的高氯酸溶液提取,C18反相色谱柱分离,254 nm波长处测定,外标法定量,测定了兰州鲇、鲇(Silurus asotus)、黄河鲤(Cyrinus carpio)3种鱼类肌肉中的肌苷酸含量。结果显示:该方法线性关系良好,相关系数r≥0.999;灵敏度高,检出限为2.5×10-4g/kg;加标回收率≥94.0%;方法精密度好,RSD≤2.5%。兰州鲇、鲇和黄河鲤的肌苷酸含量分别为1.18 g/kg、0.733 g/kg和0.504 g/kg。     

斑点叉尾鮰和蓝点马鲛鱼皮中胶原蛋白的提取与性质研究

选取淡水鱼斑点叉尾鮰(Ictalurus punctaus,以下简称鮰鱼)和海水鱼蓝点马鲛(Scomberomorus niphonius,以下简称鲅鱼)鱼皮作为原料,进行胶原蛋白的提取研究。提取方法改良如下:在预处理阶段,鱼皮样品被尽可能切碎且调节溶液更换频率;在提取阶段,在盐析步骤前,添加三羟甲基氨基甲烷粉末将醋酸溶液的酸碱值调节至中性。结果表明,应用改良后的方法提取胶原蛋白,提取周期缩短为7 d。鮰鱼鱼皮胶原蛋白的变性温度是36.5℃,鲅鱼鱼皮胶原蛋白是30.5℃。水解电泳图谱显示,鲅鱼鱼皮胶原蛋白比鮰鱼鱼皮胶原蛋白更易被完全水解,鮰鱼鱼皮胶原蛋白比鲅鱼鱼皮胶原蛋白更稳定。     

血粉复合发酵蛋白替代鱼粉对彭泽鲫的生长性能和肝脏功能的影响

以血粉复合发酵蛋白(Fermented blood meal protein,FBP)分别等量替代对照组日粮中37.5%、62.5%和100%的鱼粉,研究了FBP对彭泽鲫(Carassius auratus)的生长性能和肝脏功能的影响。结果显示,随着替代比例的增加,彭泽鲫的增重率呈下降趋势,饲料系数依次上升,但替代37.5%鱼粉组的增重率和饲料系数与对照组差异不显著;肠道消化酶活性、肝脏谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性和GPT/GOP比值随替代比例的增加而下降,碱性磷酸酶活性呈上升趋势。在37.5%替代比例下,彭泽鲫肝脏抗氧化能力与对照组差异不显著。本实验说明,FBP替代鱼粉的比例不宜超过37.5%。     

大鲵细胞与大鲵虹彩病毒的微载体规模化培养工艺及优化

利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。     

罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究

胶原蛋白用途广泛,其制品已应用于医药、保健品、食品、化妆品等众多领域。如胶原护肤霜、胶原面膜、胶原美容口服片等系列产品,其内服外用效果良好,满足了当前消费者对功能性产品的强烈需求;目前在欧美国家,服用胶原产品进行皮肤深层养护已成时尚。据专家预测,我国的胶原热潮也即将到来。胶原也是人类皮肤的主要组成成分。人处于幼年时,皮肤中胶原的含量高,随着年龄的增长,其含量开始逐渐下降,导致皮肤渐渐丧失保湿功能,人体只有不断合成新胶原才能保持皮肤健康且具有弹性。胶原蛋白的阴离子侧链丰富,能吸附大量水分,维持皮肤的湿润、弹性。胶原蛋白含有一种独特的氨基酸——羟脯氨酸（Hyp）,合成新胶原蛋白时需要大量的羟脯氨酸。除化妆品外,在医疗用品方面还研制了胶原止血纱布及胶原创可贴,应用于外科手术、战地救护,其市场巨大,前景广阔。以往,很大一部分胶原蛋白是从陆生哺乳动物中提取的,近年来,由于疯牛病和口蹄疫的影响,人们已经开始从鱼类中提取胶原蛋白,所提取的胶原蛋白更为安全。     

大鲵精液离体保存的初步研究

针对大鲵(Andrias davidianus)的性腺发育不同步,为提高受精率,对其精液特性和保存条件进行初步研究。人工辅助采集精液,对精液量、酸碱度、密度、活力等基本特性进行常规测定。分别对保护液、光照、温度等保存条件进行分组研究试验。结果表明：雄性亲鲵的精液量最大可达12 ml/kg,pH值6.7～7.0微酸状态,密度215～1075万/ml,精子活力为0.7～0.9。离体保存条件下,室温暗环境（20LUX）较光环境（400LUX）可延长存活时间0.5h,暗环境低温（0～4℃）较室温（21～22℃）可延长存活时间3d,低温暗环境原精液中添加保护液比对照组精子存活时间延长6～12h。     

鲤鱼鳞酸溶性胶原蛋白提取的研究

研究了以酸法提取鲤鱼鳞胶原蛋白过程中温度、时间、乙酸浓度的影响,并以SAS对影响因素进行了回归分析,得到了鲤鱼鳞胶原蛋白提取的最佳条件,温度18℃、提取时间38 h、乙酸浓度为1.3 m ol/L,在提取之前,采用Na2CO3处理对胶原蛋白提取有较大的提高。为淡水鱼综合加工利用提供理论依据。     

中华鳖裙边胶原蛋白的提取及其特征

胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质,也是结缔组织的主要蛋白成分。与陆生动物(如猪、牛等)比较,水生动物胶原蛋白具有优良的理化性质和生理活性功能,已引起人们的广泛关注。中华鳖是我国传统的名贵水产品,其裙边胶原蛋白含量丰富,具有极高的药用价值和营养价值。采用胃蛋白酶酶解法在酸性条件下提取中华鳖裙边胶原蛋白,研究酶添加量、底物浓度、提取时间对提取效果的影响,确定了制备裙边胶原蛋白的最适条件为：酶添加量4 mg/mL,底物浓度4%,提取时间14 h。粗提胶原蛋白通过盐析、透析等纯化步骤,再经SDS-PAGE电泳、热变性温度测定、紫外及傅立叶变换红外扫描等技术方法分析了胶原蛋白的生化特征,结果显示提取到的裙边胶原蛋白具有较高的纯度,含有两条α链和1条β链,属于典型的I型胶原蛋白。研究表明：中华鳖裙边胶原蛋白可以作为猪皮、牛皮胶原蛋白的有效替代品,这为今后进一步综合开发利用鳖类裙边胶原多肽提供了科学的理论依据。     

大鲵蛙病毒感染大鲵的动态病理损伤及病原的组织分布

本研究旨在观察大鲵在大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)感染过程中组织的动态病理损伤,同时定量检测CGSRV在组织中的动态分布。对大鲵腹腔注射1.0×106.5 TCID50/m L的CGSRV进行人工感染,在感染的0d,3d,5d,7d,9d,13d,16d随机采集3尾,取肝、肾、脾、肺、肠、皮肤、肌肉、脑、心脏和胃等组织,石蜡切片和HE染色对CGSRV感染大鲵的病理损伤过程进行观察,采用SYBR Green q PCR技术对病毒在组织中的动态分布进行定量研究。组织病理结果表明,CGSRV感染导致大鲵多组织器官损伤,其中肝、脾、肾和皮肤肌肉病变严重,为损伤靶器官,且在一些损伤的细胞内见嗜碱性或嗜酸性包涵体。感染后3d肝细胞与肾小管上皮细胞变性,肾间以及肝小叶中央静脉周围淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润;感染后5~7d实质性器官变性、坏死,炎症加重,胃肠道呈卡他性炎。感染后9d表皮细胞坏死、脱落,肌纤维变性、坏死。感染后13~16d肝出现广泛变性、坏死与炎症,脾淋巴细胞数量显著减少,肾小球渗出性-坏死性炎,皮肤肌肉呈出血性坏死性炎和实质性心肌炎。SYBR Green qPCR结果显示,整个感染进程中各组织CGSRV含量呈上升趋势,不同组织中病毒量为2.36×103~1.84×109 copy/mg组织,其中肺、肠、肝、脾、肾和皮肤肌肉含量高,表明CGSRV具有广泛的组织分布特征,但肝、脾、肾、皮肤肌肉为其复制和损伤的靶器官,且病毒分布量与病理损伤程度呈正相关。     

仿刺参胶原蛋白的提取及理化性质

对仿刺参（Stichopus japonicus）胶原蛋白的提取及理化性质进行了研究。结果表明,低温提取可得到胃蛋白酶促溶且去除端肽(telopeptide)的酸溶性胶原蛋白（PSC）。紫外-可见扫描测得PSC的最大吸收峰位于220 nm;氨基酸分析发现,在1 000个总氨基酸残基中,甘氨酸为329个,羟脯氨酸为66个,羟脯氨酸与脯氨酸之比为0.69,酪氨酸、苯丙氨酸及组氨酸的含量较低,可能不含胱氨酸,这些特性均符合Ⅰ型胶原的特征。差示量热扫描法（DSC）测定仿刺参PSC的热稳定性温度（T^s）为57 ℃,低于牛皮Ⅰ型胶原5 ℃;苯酚-硫酸及次甲基蓝法测得PSC的总糖及粘多糖含量分别为0.61％及0.48％;经DEAE52纯化后,可得到除去粘多糖的蛋白纯品。SDS-PAGE显示,本研究所提取的仿刺参PSC不含杂蛋白,主要成分为胶原β及α链,含少量γ链;其中α链类似于脊椎动物Ⅰ型胶原α¹链,PSC分子组成为（α¹）3。     

草鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取及基本特性

利用胃蛋白酶从草鱼鱼鳞中提取酶溶性胶原蛋白(PSC)。并用氨基酸自动分析仪、SDS-PAGE电泳、DSC、FT-IR和圆二色谱对草鱼鱼鳞胶原蛋白的氨基酸组成、相对分子量、变性温度和结构进行了研究。试验结果表明:所提草鱼鱼鳞蛋白为典型的I型胶原蛋白;且至少含有2条α链,α1和α2链;DSC分析表明其变性温度为37.1℃。     

鱿鱼皮胶原蛋白的提取及在化妆品中的应用

胶原蛋白对皮肤具修复和滋养作用,又有良好组织相容性[1],成为美容界流行和推崇的化妆品原料.鱿鱼皮中胶原蛋白含量较高,约占质量的37%[2],采用适宜方法提取胶原蛋白,并应用到化妆品中,开发鱿鱼皮胶原蛋白美容制剂,具有良好产业化前景.     

斑点叉尾(鱼回)鱼骨制取胶原蛋白和骨粉的试验研究

鱼骨中蛋白质的存在会影响骨钙的吸收,将鱼骨中的蛋白提取出来加以利用,钙质保留在骨中,既充分利用了鱼骨中的蛋白质成分,又使高钙成分利于吸收,可以实现资源利用的"零废弃".试验在4℃条件下,斑点叉尾NFDAA(长吻NFDAA,Ictalurus punctatus)鱼骨先用0.1 mol · L-1的NaOH浸泡6 h,再用2.5%NaCl浸泡6 h去除杂蛋白,用10%的异丙醇溶液去除脂肪,0.1 mol · L-1的柠檬酸浸提3 d能较好的提取胶原蛋白,无色无味,提取率可达11.87%.粗提液再经盐析、透析可得到纯度较高的胶原蛋白制品.鱼骨胶原蛋白溶液的粘度随着蛋白浓度的增大而增大,其变性温度为33.9℃.SDS-PAGE试验结果表明,提取的NFDAA鱼骨胶原具有较高的纯度,含有2条α链,β链含量较高.提取胶原后的NFDAA鱼骨粉钙含量可达60%,作为钙添加剂加到饼干中,不会对饼干的口感和味道造成显著性差异,是良好的钙添加剂,可用于食品再加工.     

大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

为探讨β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的最适条件,研究了BPL对GSIV的灭活方法。采用终浓度分别为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条件下分别灭活24 h、48 h、72 h、96 h,通过细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定最适灭活条件。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.1%的BPL 4℃灭活处理72 h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应(CPE)出现,病毒主衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。灭活效果检测结果表明,与未灭活GSIV相比较,最适灭活条件下的GSIV结构蛋白与抗原性未发生显著变化。结论显示BPL可用来灭活GSIV,本研究确立了BPL灭活GSIV的最适条件,为大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗研究奠定了重要基础。     

一株大鲵虹彩病毒的分离及鉴定

2020年5月,广东广州某野生动物保护基地爆发疑似病毒引发的疾病。现场采样发现,病鲵体长约2 m,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究采用胖头鲤肌肉细胞系(fat head minnow epithelial cells, FHM)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大鲵中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大鲵虹彩病毒广州分离株(CGSIV-GZ)。FHM经患病大鲵组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的FHM细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,FHM细胞中存在大量直径约100～120 nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鲵组织样本进行PCR扩增,获得了431 bp的目的基因片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次野生动物保护基地大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致。     

工厂化养殖条件下大鲵适宜养殖密度的研究

在工厂化养殖条件下,研究了养殖密度对2~5龄大鲵(Andrias davidianus)摄食与生长的影响。结果表明:2龄大鲵适宜养殖密度为27尾/m2,该组特定生长率显著高于9尾/m2组、18尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低;当养殖密度为17尾/m2时,3龄大鲵的增重率、特定生长率最大,饵料系数最低且与低密度5尾/m2组差异显著(P<0.05),确定3龄大鲵的适宜养殖密度为17尾/m2;4龄大鲵特定生长率的最大值出现在养殖密度为10尾/m2,显著高于16尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低,4龄大鲵的适宜养殖密度为10尾/m2;5龄大鲵的适宜养殖密度为5尾/m2,特定生长率与高密度组9尾/m2差异显著(P<0.05),饵料系数最低。大鲵适宜养殖密度与体重存在显著的负相关性,关系式为y=-0.016 4x+25.34(r2=0.839 9)。     

仿刺参酸性磷酸酶的提取及粗酶性质研究

试验结果表明,仿刺参酸性磷酸酶的最佳提取缓冲液为 pH 7.5的Tris-HCl缓冲液,最佳沉淀条件为饱和度为80 %的硫酸铵.仿刺参体壁和肠道中的酸性磷酸酶最适反应条件均为:40 ℃,pH 4.0.Ca2+、Mg2+和Mn2+对体壁酸性磷酸酶有激活作用,而Fe3+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+对其有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最强;肠道酸性磷酸酶表现的特征与之类似,但Zn2+的抑制作用最强.PAGE电泳结果表明,仿刺参体壁和肠道中的酸性磷酸酶类型不同,肠道中有3种同工酶.