预防性给予生物活性肽对巨噬细胞抵御LPS刺激的调节作用

预防性给予巨噬细胞(RAW264.7细胞)不同浓度的生物活性肽Gln-Glu-Pro-Val(QEPV)后,用脂多糖(LPS)刺激细胞,通过检测细胞因子表达和炎性蛋白基因转录,观察生物活性肽QEPV对细胞抵御LPS刺激的调节作用。结果表明,0.1g/L的QEPV有显著的促进细胞增殖作用,0.5g/L浓度以下的QEPV对RAW264.7细胞无增殖抑制作用。0.5g/L QEPV预处理RAW264.7细胞后,用LPS刺激细胞,其IL-6、IL-12等促炎细胞因子的分泌降低,抗炎细胞因子IL-10分泌提前,分泌量增加,COX-2、iNOS基因的转录水平降低,说明乳源性生物活性肽QEPV对RAW264.7细胞抵御LPS刺激起正向调节作用。     

VP_4和VP_5蛋白在鸡传染性法氏囊病毒感染Vero细胞中的作用

[目的]鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染会引起鸡的免疫抑制,给养禽业带来巨大危害。本文旨在探讨鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)蛋白VP4和VP5在病毒感染引起的免疫抑制中的作用。[方法]构建VP4和VP5蛋白的真核表达质粒并转染Vero细胞,再用IBDV CV03病毒株感染转染后的细胞,Western-blot方法检测细胞中模式识别受体及下游转录因子的表达;RT-q PCR检测细胞因子及抗病毒基因的表达。[结果]IBDV CV03病毒感染Vero细胞后,VP4蛋白在一定程度上能够提高TLR3、RIG-Ⅰ蛋白含量,但差异不显著;VP5对TLR3、RIG-Ⅰ等介导的天然免疫通路有一定的抑制作用;过表达VP5在IBDV CV03病毒感染后显著抑制了Vero细胞IRF3的表达及其磷酸化水平,也显著抑制了IRF7蛋白和NF-κB基因的表达,并在抑制NF-κB后抑制了TNF-α,而过表达VP4无此作用。[结论]VP5蛋白对Vero细胞相关信号通路有一定的抑制作用,这种抑制作用和核转录因子及TNF-α的抑制密切相关。     

用反向遗传8质粒系统构建流感H1N1重组病毒

为了建立用于流感病毒拯救的反向遗传操作系统,用RT-PCR方法扩增得到A型流感病毒流行株A/shanghai/7/99的HA和NA基因,将其克隆到pGEM-T载体上并测序,挑选阳性克隆分别用BsmBⅠ、BsaⅠ酶切,连接到以BsmBⅠ酶切的双向转录/表达载体pAD3000上,获得重组质粒pAD-HA和pAD-NA,分别与含A/PR/8/34流感病毒7个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,拯救了重组病毒R-HA-PR8和R-NA-PR8,说明构建的重组质粒pAD-HA和pAD-NA是正确的,将pAD-HA和pAD-NA与含A/PR/8/34流感病毒6个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,培养48 h后吸取上清液及COS-1细胞,接种10日龄SPF鸡胚,孵育96 h后,收获鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验。结果显示,鸡胚尿囊液中重组病毒H1N1的血凝效价和血凝抑制效价均为29,鸡胚半数感染剂量为10-8.5~10-9。病毒的成功拯救为进一步深入研究流感病毒的基因功能以及流感新型疫苗的研发奠定了基础。     

荧光素酶报告系统检测大肠杆菌代谢产物调控STC-1细胞表达胆囊收缩素研究

[目的]本文旨在筛选出可调控肠道Ⅰ细胞表达胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)的大肠杆菌代谢物,建立可方便检测CCK表达的STC-1细胞模型。[方法]利用分子克隆技术构建含有CCK启动子调控荧光素酶的慢病毒载体,包装慢病毒并感染STC-1细胞,获得STC-1/CCK-Luc细胞系。用大肠杆菌基因敲除株培养液上清处理上述细胞,检测荧光素酶活性,确定可影响CCK表达的大肠杆菌基因及代谢产物。使用纯化的代谢产物处理STC-1细胞及肠道类器官,通过Western blot及免疫荧光法检测CCK表达水平的变化。[结果]酶切鉴定及DNA测序表明慢病毒载体构建成功,荧光素酶活性检测发现大肠杆菌ΔSapD株菌液上清可显著抑制荧光素酶的表达。敲除SapD基因可以使培养液中腐胺水平下降,而腐胺可以上调STC-1细胞及肠道类器官中CCK的表达。[结论]成功构建了能够体外检测CCK表达的细胞系,筛选出1个能够调控CCK表达的大肠杆菌突变体。     

漆黄素对单增李斯特菌致BeWo细胞炎症反应的抑制作用

试验采用单增李斯特菌感染Be Wo细胞建立实验模型,利用MTT方法检测漆黄素细胞毒性,利用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫蛋白印迹(Western Blot)试验分别验证了漆黄素抑制炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的表达,以及核转录因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信号转导通路的影响。结果发现:漆黄素显著减弱了炎性细胞因子的表达,同时抑制了NF-κB的激活,这说明漆黄素对单增李斯特菌致Be Wo细胞炎症反应的抑制作用显著。     

NMRAL1对流感病毒复制的调控机制

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原,常引起大流行,给人类健康造成巨大威胁,且流感病毒易发生变异,能不断逃逸宿主细胞的免疫反应,对现有抗流感药物产生耐药性,因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响,并揭示其发挥作用的分子机制,为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1,并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平;在下调表达NMRAL1的细胞中,分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05) (H5N1)和A/WSN/33 (H1N1) 两株不同亚型流感病毒,利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段,在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1,通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响;使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色,通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响,判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程;利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响,利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达,在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒,并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度,结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中,感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降,表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制;为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制,利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性,发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响;激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程,同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达;但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升,且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中,NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程,而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达,最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制,丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。     

钙调素拮抗剂三氟拉嗪对犬肾上皮细胞增殖的影响

为探讨钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP)对犬肾上皮细胞(MDCK)增殖的抑制作用及对细胞各周期时相的影响,采用细胞计数法、流式细胞术、[γ-32P]ATP掺入外源性底物的液体闪烁法和免疫组化技术,分别测定5、10和15μmol/L浓度的TFP对MDCK细胞增殖的抑制作用、细胞各周期时相的百分率、胸苷激酶(TK)的活性以及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的阳性率。结果表明:给药3 d后,各浓度TFP对MDCK细胞生长均具有明显抑制作用;G0/G1期的细胞比率均显著增加(P<0.05),而S期、G2/M期细胞的比率则有所下降,其中高浓度TFP组显著下降(P<0.05);细胞内TK的活性和PCNA的表达显著降低,呈明显的时间剂量效应关系。说明TFP可通过阻断钙调素信号通路,影响DNA合成和细胞周期而抑制MDCK细胞的增殖。     

猪圆环病毒2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

通过PCV2病毒感染3D4/21猪肺泡巨噬细胞后炎症相关细胞因子mRNA转录水平变化,探讨PCV2感染后可能的致病途径。通过PCV2病毒体外接种3D4/21细胞,感染不同时间后,收集样品,采用荧光定量PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-8及IL-18mRNA转录水平的变化。结果显示PCV2对3D4/21细胞的IL-1β、IL-8转录主要起抑制作用,对IL-8转录起促进作用。推测其在体内的综合效应导致感染早期机体抗病毒能力降低,引起机体免疫抑制,影响机体特异性免疫应答的正常运转,为PCVD的发病创造了条件。     

H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪CDK9基因表达的影响

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏CDK9基因表达的影响,揭示流感发病机制与CDK9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感染7d后,仔猪肺脏CDK9的mRNA和蛋白表达的变化,并在电子显微镜下观察CDK9阳性细胞的定位。【结果】实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪7d后,肺脏组织内CDK9基因mRNA的相对表达量分别为0.42和0.36,与对照(1.0)相比显著降低(P<0.05)。半定量免疫组织化学检测结果显示,仔猪受到H3N2和H1N1流感病毒感染后,肺脏组织内CDK9蛋白的相对表达水平分别为31.4和38.7,较正常组织(61.4)显著降低(P<0.05)。电子显微镜观察发现,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪后,肺脏细胞界限不明显,CDK9阳性细胞散在分布于终末细支气管和肺泡内,且胞核着色较深,但是细胞整体着色变浅。【结论】受到流感病毒感染后,仔猪肺脏组织内CDK9表达量降低,可能是RNApolⅡ磷酸化水平降低的原因之一。     

苹果多酚体内外抗甲型流感病毒作用

体外试验利用甲型流感病毒感染狗肾细胞(MDCK)致细胞病变(CPE)模型评价苹果多酚对流感病毒复制的抑制作用;体内试验利用小鼠感染流感病毒致鼠肺适应株模型,以死亡保护率和生命延长率等为指标,评价苹果多酚体内抗流感病毒作用。利用体外不同作用模式试验、不同作用时间点试验和血凝抑制试验(HI)研究苹果多酚抗流感病毒作用机制。研究结果表明,苹果多酚对甲型H9N2、H3N2和H1N1 3种亚型流感病毒引起的细胞病变表现出不同程度的抑制作用,50%抑制浓度(IC50)分别是0.012、0.0042、0.003 mg/mL。200 mg/(kg.d)剂量苹果多酚对H1N1亚型流感病毒感染小鼠有明显的保护作用和延长生命率的作用(P<0.05)。苹果多酚对3种亚型流感病毒的血凝抑制最小浓度(MIC)在0.25～0.5 mg/mL范围之间。对病毒复制周期的吸附和穿入的抑制作用是其主要作用机制。说明苹果多酚在体内外均具有显著的抗流感病毒作用。     

扬州市近3年新甲型H1N1流感病毒HA基因分析

采用Real time PCR(RT-PCR)对患者鼻咽拭子样品进行检测,筛选新甲型H1N1流感病毒。将阳性样品接种MDCK细胞进行病毒分离,通过RT-PCR扩增病毒HA基因并进行测序分析,分析扬州市2009～2011年新甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因的遗传进化特征。结果表明:分离出9株新甲型H1N1流感病毒,其HA基因核苷酸及氨基酸同源性分别为98.1%～99.8%和96.6%～99.8%;与疫苗株A/California/07/2009相比,核苷酸及氨基酸的同源性分别为98.4%～99.5%和97.0%～99.3%,其中2011年3株病毒在抗原位点上发生了点突变。遗传进化分析显示9株病毒形成3个明显的分支。证明新甲型H1N1流感病毒已发生了一定抗原漂移。     

犬瘟热病毒基因疫苗表达载体构建及在真核细胞中的表达

利用pCI载体构建了犬瘟热病毒基因疫苗表达载体质粒pCIF和pCIN,通过脂质体介导法将这两种真核表达质粒分别转染MDCK细胞,用RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白是否表达。结果表明,真核表达质粒pCIF和pCIN已被成功构建,这两种重组质粒转染MDCK细胞72h后就可检测到目的基因的转录和两种目的蛋白的表达,表达的蛋白均能与抗CDV抗体发生特异性的抗原抗体反应。这为研究预防犬瘟热的基因疫苗奠定了良好的基础。     

泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒的体外抑制作用研究

为分析泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的体外抑制作用，本研究使用CCK-8法检测泽漆水提取物对非洲绿猴肾细胞(Vero CCL-81)增殖活力的影响，通过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR方法检测泽漆水提取物对PEDV的抑制作用和时间依赖关系。以广谱抗病毒药利巴韦林(Ribavirin)为阳性对照药物，探究泽漆水提取物对PEDV生命周期各个阶段的影响。结果表明:1)泽漆水提取物浓度≤500 μg/mL时在12、24 和36 h细胞无毒性。2)泽漆水提取物以剂量依赖方式显著降低PEDV-N mRNA的表达量及PEDV 病毒滴度。3)泽漆水提取物可长时间有效抑制PEDV-N蛋白的表达，预防给药对PEDV-N蛋白表达无明显抑制效果。4)泽漆水提取物在病毒复制周期的吸附及复制增殖阶段对PEDV-N蛋白的表达具有显著抑制作用，在入侵阶段对PEDV-N蛋白的表达无明显抑制效果。综上，泽漆水提取物在体外对PEDV具有显著抑制作用，主要作用于PEDV生命周期的吸附和复制增殖阶段。本研究为深入挖掘泽漆抗病毒优势奠定了基础。     

黄连水提物抗甲型流感病毒活性初步研究

目的观察黄连水提物对甲型流感病毒（IAV）活性的影响。方法 CCK-8法检测黄连水提物对狗肾传代（MDCK）细胞的毒性作用。采用反向遗传8质粒病毒拯救系统制备IAV后,CCK-8和CPE法检测黄连水提物抗IAV活性。利用荧光素酶编码基因报告系统研究黄连水提物对IAV感染性和RNA聚合酶活性的影响。结果黄连水提物在0.25~2.0g/L质量浓度内,对MDCK细胞有一定安全性。黄连水提物有较好的抗IAV作用。与对照组比较,黄连水提物处理组细胞的相对荧光强度明显降低（P〈0.01）。结论黄连水提物对IAV活性及感染性有较强抑制作用,可能与抑制病毒RNA聚合酶活性有关。     

千里光石油醚提取物对LPS激活的炎症反应的抑制效应

以千里光石油醚提取物（PEESS）为材料,以脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为炎症模型,通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测一氧化氮（NO）含量、RT-PCR法检测炎症相关因子的表达,及Western blot法检测炎症关键转录激活因子的活化,研究PEESS的抗炎作用及可能的分子机制。结果显示,0~80 μg/mL的PEESS对巨噬细胞增殖无明显影响,但能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌,并呈浓度依赖性;炎症相关因子基因mRNA表达检测结果显示：PEESS能显著抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞炎症模型中IL-1β及IL-6的表达;同时,PEESS还显著降低了NF-κB p65及 p44/p22 MAPK蛋白的磷酸化水平。以上结果表明,千里光石油醚提取物对LPS 诱导的RAW264.7 细胞炎症模型具有较好的抗炎效应,其作用发挥可能与其抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化以及NO、IL-1β和IL-6等炎症介质的分泌有关。     

刺五加苷B对仔猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白及细胞因子mRNA表达量的影响

以仔猪小肠上皮细胞为模型,应用实时荧光定量PCR方法测定相关基因指标,研究刺五加苷B(EB)对仔猪小肠上皮(IPEC-J2)细胞紧密连接蛋白及炎性细胞因子mRNA表达量的影响。结果表明:0.1 mg/m L刺五加苷B显著增强肠道细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-3、ZO-1和抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的mRNA表达量,且减弱促炎性细胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ的mRNA表达量。说明刺五加苷B可通过改变细胞间紧密连接蛋白和细胞因子的表达从而对维持肠道屏障功能的完整性起到促进作用,有益于仔猪肠道的健康发育。     

下调DKK2表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响

[目的]本试验旨在研究RNA干扰Dickkopf-2基因(DKK2)表达对小鼠子宫内膜基质细胞增殖和凋亡的影响。[方法]设计并合成3条针对DKK2基因的siRNA,在转染试剂LipofectamineTM2000介导下转染小鼠子宫内膜基质细胞,用RT-q PCR法检测转染前、后DKK2基因的表达量,筛选干扰效率最高的1条siRNA。用该siRNA转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h,利用Caspase3活性和Annexin-V FITC/PI双染法检测干扰DKK2基因对细胞凋亡的影响;用CCK8细胞计数法检测该siRNA干扰DKK2基因不同时间对小鼠子宫内膜基质细胞增殖的影响。[结果]3条siRNA均能有效抑制DKK2基因的表达,RT-q PCR结果显示DKK2基因表达水平显著降低(siRNA2,P0.05;siRNA1、siRNA3,P0.01);CCK8法结果显示siRNA干扰DKK2后对小鼠子宫内膜基质细胞有明显的抑制作用(24 h、48 h,P0.05);Caspase3活性检测和Annexin-V FITC/PI双染法结果显示,siRNA1转染小鼠子宫内膜基质细胞24 h后,Caspase3活性明显增加(P0.01),细胞凋亡率明显增加(P0.01),凋亡率为18.48%。[结论]利用RNA干扰技术沉默DKK2基因的表达可以明显抑制小鼠子宫内膜基质细胞的增殖并促进凋亡。     

MDCK细胞ISG15基因的克隆表达及抗病毒活性分析

为了解ISG15基因体外抗病毒机制,应用RT-PCR方法扩增了MDCK细胞的ISG15基因,经测序分析,该基因序列与Gen Bank中登录的犬属ISG15基因序列相似性为99%。将该基因亚克隆至p ET-28a载体构建出重组原核表达质粒p28a-M15;工程菌p28a-M15/BL21经IPTG诱导表达,获得了约22 k D的重组目的蛋白,重组蛋白经Ni2+柱层析纯化。于H9N2亚型禽流感病毒S2株感染前后在MDCK细胞中定量加入纯化的ISG15蛋白,结果显示,病毒感染MDCK细胞前加入ISG15蛋白可以抑制病毒的复制,但病毒感染后添加该蛋白则促进了病毒的复制。     

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究

 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA（shRNA）的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50％,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。