甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

【目的】甘薯的病毒种类比较多,不同的病毒感染会引起相应的症状变化,田间自然发病的甘薯表型不一,这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术,对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶,样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序,利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA,并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证,鉴定基因和病毒在样本中表达情况,分析测序数据的可靠性,利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析,探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对,发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒,如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2,SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G,SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C,SPVC）等,但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致,样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异,通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA,通过配对比较分析,其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达,并且这些miRNAs,如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时,采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致,另外,与脱毒苗样本进行比较,检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达,证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析,发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子,编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域,这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性,表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达,并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。     

2020-06ml 目录

目的异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物,前人研究发现,胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析,揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。方法以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料,通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。结果共获得6个高质量的sRNA文库,各文库有效序列占原始序列的56% ~ 81%。通过比对,共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA,主要长度分布区间为20 ~ 22 nt,其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个,与披针形叶片相比,锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达,15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析,发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径,如对盐胁迫的响应,磷酸肌醇代谢,角质、软木脂和蜡的生物合成,碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致,通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。结论胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中,调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调,参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达,推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异,同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。      

一个新的小麦非生物胁迫诱导基因的克隆及表达特性

 【目的】水分胁迫和低温是制约植物生长发育的重要限制因子，研究植物感知、传递胁迫信号，并对重要的基因进行克隆对改良作物的抗性有重要意义。本试验的目的是克隆与水分胁迫相关的基因，通过基因的功能进一步了解植物的抗旱机制，并为抗逆育种提供候选基因。【方法】试验应用噬菌体原位杂交技术从小麦旱胁迫cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因片段W89。用5′-RACE和RT-PCR方法，获得了W89基因的全长序列。【结果】W89全长cDNA为2 392 bp，其中，编码区长1 896 bp，编码631个氨基酸。Southern杂交表明，W89是一个单拷贝基因。RT-PCR结果表明，W89受干旱、低温和ABA的诱导。氨基酸序列分析发现W89有一个DUF248保守区（pfam03141），包含一个具有SAM （Sterile Alpha Motif）结合基序的甲基转移酶区。同源性分析发现W89与一个水稻干旱诱导蛋白（BAD67956）的同源性为66%，推测W89可能是一个新的小麦干旱诱导的基因。【结论】根据甲基转移酶和SAM结合基序的功能，推测W89的SAM结合基序可能与其它蛋白或转录因子相互作用调控植物胁迫基因的表达，并且可能在干旱胁迫的早期调控信号的转导。     

Comparative proteomic analysis of cold responsive proteins in two wheat cultivars with different tolerance to spring radiation frost

Spring radiation frost (SRF) is a severe environmental stress which impairs wheat yield and productivity worldwide. To better understand the mechanism of wheat (Triticum aestivum) responding to SRF, a comparative proteomic analysis was performed to analyze the changes of the key proteins in two wheat cultivars Jimai22 and Luyuan301 with high and low tolerance to SRF respectively. A total of 43 differentially expressed proteins (DEPs) which mainly involved in carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, resistance proteins and antioxidant enzymes, photosynthesis and cellular respiration proteins, cell-wall related proteins, protein translation/processing/degradation and signal transduction were isolated and identified by two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF-TOF MS. The results revealed that of the 21 DEPs in Jimai22 responding to the SRF, 13 DEPs were upregulated and 8 DEPs were downregulated, and that of the 22 DEPs in Luyuan301, 9 DEPs were upregulated and 13 DEPs were downregulated. These DEPs might be responsible for the stronger cold resistance of Jimai22 compared to Luyuan301. The expression pattern and function analysis of these DEPs were very significant to understanding the mechanism of the SRF responses in wheat.     

Identification of Zinc Deficiency-Responsive MicroRNAs in Brassica juncea Roots by Small RNA Sequencing

The importance of zinc （Zn） as a micronutrient essential for plant growth and development is becoming increasingly apparent. Much of the world’s soil is Zn-deficient, and soil-based Zn deficiency is often accompanied by Zn deficiency in human populations. MicroRNAs （miRNAs） play important roles in the regulation of plant gene expression at the level of translation. Many miRNAs involved in the modulation of heavy metal toxicity responses in plants have been identiifed;however, the role of miRNAs in the plant Zn deifciency response is almost completely unknown. Using high-throughput Solexa sequencing, we identiifed several miRNAs that respond to Zn deifciency in Brassica juncea roots. At least 21 conserved candidate miRNA families, and 101 individual members within those families, were identiifed in both the control and the Zn-deifcient B. juncea roots. Among this, 15 miRNAs from 9 miRNA families were differentially expressed in the control and Zn-deifcient plants. Of the 15 differentially expressed miRNAs, 13 were up-regulated in the Zn-deifcient B. juncea roots, and only two, miR399b and miR845a, were down-regulated. Bioinformatics analysis indicated that these miRNAs were involved in modulating phytohormone response, plant growth and development, and abiotic stress responses in B. juncea roots. These data help to lay the foundation for further understanding of miRNA function in the regulation of the plant Zn deifciency response and its impact on plant growth and development.     

水稻低温应答基因OsLCL3的分离与功能鉴定

为探明水稻响应低温的分子机制,改良水稻对低温的抗性,从水稻低温诱导表达谱中挑选了1个受低温诱导的基因OsLCL3,通过实时定量PCR和启动子驱动GUS报告基因转化水稻的方法验证其功能。对OsLCL3进行同源蛋白搜索,发现它属于DUF761超家族,并对这个超家族中的部分蛋白序列进行了系统树分析;通过水稻原生质体瞬时表达系统,初步确定OsLCL3蛋白定位于细胞核和细胞质中。在水稻中超量表达OsLCL3基因,并对转基因植株进行低温胁迫处理,发现超量表达OsLCL3的植株在低温胁迫下的电导率显著低于野生型对照植株,胁迫后超量表达植株的存活率显著高于野生型对照植株。结果表明,OsLCL3可能在水稻对低温的应答中起着重要作用。     

杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析

目的鉴定杨树受低氮胁迫后miRNA的靶基因,分析靶基因在氮胁迫后的差异表达并探讨其功能,为揭示杨树低氮胁迫下miRNA的调控功能提供参考,并为树木低氮营养高效利用育种提供重要的候选基因。方法根据miRNA的保守性及与靶基因的严谨互补配对关系,以杨树miRNA为探针利用靶基因预测软件psRNATarget,通过与毛白杨转录组的基因序列进行比对鉴定靶基因,进一步开展毛白杨受低氮胁迫后靶基因的差异表达分析及功能注释。结果获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,分别参与了植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路。57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导（29个）和抑制（28个）的基因数目相当。14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA。本研究发现参与植物激素信号转导的靶基因（2个）及参与代谢途径的靶基因（6个）发生了差异表达。miR162的靶基因编码ABC转运蛋白,miR393运用于靶基因KAT2调节Na+和K+动态平衡,miR399的靶基因PIF3编码光敏色素互作因子PIFs蛋白,这些miRNA及靶基因可能在杨树响应低氮胁迫中发挥重要作用。结论本文鉴定到了毛白杨中一批低氮胁迫响应miRNA的靶基因,可调控杨树对氮逆境胁迫信号的反应。这些miRNA及靶基因为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的调控功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。      

水稻根系盐胁迫响应miRNA和tRF的鉴定

【目的】水稻(Oryza sativa L.)是中国最重要的粮食作物,也是盐胁迫敏感作物。研究水稻盐胁迫响应基因表达,发掘水稻耐盐基因对水稻抵御盐胁迫的分子机制及解析其调控网络,为培育耐盐水稻品种奠定基础。【方法】以水稻品种日本晴种子为试验材料,在1/2MS培养基培养条件下对其进行盐处理(150 mmol·L-1 NaCl),对盐处理和非盐处理21 d的根系进行小分子量RNA组学测序。通过生物信息学分析,以log2 Fold Change(log2FC)>1或<-1为筛选条件,寻找在盐胁迫和非盐胁迫条件下差异表达的miRNA和tRF(tRNA-derived RNA fragments),分析其靶基因,并通过实时荧光定量PCR对测序结果及靶基因进行验证。【结果】以至少一组数据RPM(Reads Per Million reads)>500和log2FC>1或<-1为筛选条件,共得到31个差异表达miRNA,其中8个为盐胁迫诱导miRNA,23个为盐胁迫抑制miRNA,这些差异表达miRNA属于12个miRNA家族,其中8个miRNA家族在拟南芥、玉米和小麦...     

2016年广西隆安香蕉受寒情况调查与分析

2016年1月底的极端低温天气对广西隆安香蕉种植造成了严重影响.通过实地调查和检测,从香蕉植株结构及细胞结构等方面分析此次极端低温灾害天气下的香蕉受寒情况;同时进行香蕉幼苗低温模拟试验,分析此次寒害造成的影响程度;最后,提出香蕉防寒综合措施,为生产提供建议.     

不同封育年限下石灰岩山地植被 细根生物量及其动态

利用土钻法对不同封育年限下石灰岩山地植被细根生物量进行对比研究。结果表明院封育5 年林分细根 生物量为6.6287 t/hm2,封育10 年林分细根生物量为2.3063 t/hm2,封育20 年林分细根生物量为3.1316 t/hm2,封育 30 年林分细根生物量为2.8316 t/hm2;不同封育年限下细根生物量均随着土层深度的增加而降低,0~10 cm 土层的细 根生物量明显高于其他两个土层;不同封育年限细根生物量年动态变化均呈现双峰型。     

马铃薯microRNA及其靶基因的预测与功能分析

根据miRNA序列在植物中的高度保守性,通过拟南芥、水稻、玉米等植物中已知的miRNA序列与马铃薯的表达序列标签(EST)、基因组测序序列(GSS)以及核酸数据库中的序列进行比对,最后通过在线比对软件blastx去掉编码序列,共发现32条新的miRNAs,并且这32条前体均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构;利用新发现的马铃薯miRNAs通过在线软件miRU和miRU2与编码蛋白的数据库比对,预测到了100个靶基因,分别编码与马铃薯生长发育、新陈代谢、信号转导、转录调节、胁迫反应等相关的蛋白.     

陆地棉GhWDR基因的克隆和功能初步解析

WD40蛋白广泛存在于真核生物,在多种生物过程中发挥着重要作用,棉花中鲜有关于WD40蛋白的研究。本研究从陆地棉TM-1克隆了1个WD40基因GhWDR,并对该基因序列、转录及功能进行了研究。结果表明：GhWDR含有4个典型的WD40-repeat结构域,属于WD40超家族蛋白基因。在棉属中该基因高度保守,并且在葡萄、莲花等古老物种中同源序列相似度也较高,表明该基因功能保守,但其同源基因的功能均未见报导。转录分析表明GhWDR在各组织器官中广泛表达,且在迅速伸长的纤维中高水平转录,说明其可能在棉花生长发育及纤维伸长调控中发挥作用。利用模式植物拟南芥对GhWDR功能进行研究,发现其具有促进开花整合子FT和SOC1表达,加速开花的功能。此外,该基因响应冷胁迫下调表达,且启动子包含ABRE元件,推测GhWDR转录在冷胁迫下受ABA抑制。高温诱导GhWDR的表达,缩短营养生长期,使植物提早进入生殖生长,促进早熟。总之,GhWDR可能参与温度调控路径,促进开花,在棉花适应温度变暖和平衡抗寒与生长过程中发挥作用。     

高通量测序鉴定中间锦鸡儿干旱条件下的microRNA

中间锦鸡儿分布于干旱和半干旱地区,适应干旱和高温逆境环境,被广泛应用于固沙和水土保持,具有很高的生态价值。microRNA是一类非编码RNA,广泛分布于植物体内,参与干旱、盐、低温等多种胁迫响应。为了鉴定中间锦鸡儿中抗旱相关的miRNA,构建了干旱条件的small RNA文库,通过高通量测序和生物信息学分析,共鉴定得到116个miRNA,88个保守的miRNA属于33个已知miRNA家族和28个新miRNA,差异表达的miRNA中,cin-miR164a、cin-miR164b、cin-miR168a、cin-miR168b在三个干旱处理时间下调表达,cin-novel-3、cin-novel-11、cin-novel-21在干旱处理1和3 h上调表达,cin-novel-26 在干旱处理3 h特异表达;28个新miRNA通过psRNATarget在中间锦鸡儿中预测到582个靶基因,在拟南芥中预测到212个靶基因,大多数靶基因参与干旱胁迫响应。这些为后续研究中间锦鸡儿miRNA响应干旱胁迫奠定了基础。