大西洋鲑杀鲑气单胞菌的分离鉴定

从皮肤溃烂的大西洋鲑(Salmon salar)肌肉、肝、肾分离到一致病性的菌株(AB080226),经人工感染实验证实其为该病的病原菌,研究了该菌的形态、生理生化特征并对其16SrDNA序列进行了在线Classifer和Blast分析。结果显示:该菌为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长;能利用甘露醇,不具运动性,能发酵麦芽糖,葡萄糖产酸阳性,精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶阴性;该菌属于气单胞菌属的细菌,在系统发育树上与杀鲑气单胞菌形成一个簇群,同源性高达99.9%以上。综合形态学、生理生化特征及16SrDNA序列鉴定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。     

12种中草药提取物对杀鲑气单胞菌的抑制效果

为观察中草药对杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的体外抑菌效果,采用水煎煮法提取黄柏、黄芩等12种中草药活性成分,首先采用纸片法判断中草药有无抑菌作用,然后使用试管二倍稀释法测定具有抑菌效果的2种中药的最小抑菌浓度。结果表明,黄芩和连翘抑菌效果较好,黄芩的最小抑菌浓度为10 mg/mL,连翘的最小抑菌浓度为20 mg/mL,其余10种中草药抑制杀鲑气单胞菌效果不佳。     

河川沙塘鳢胚胎发育的研究

对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila Günther)的胚胎发育进行研究.结果显示:河川沙塘鳢胚胎发育可分成受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、体节分化、腮和出膜等8个阶段.根据每个阶段的形态建成和发育特点,卵裂阶段被细分为2～32细胞期和桑葚期,囊胚阶段分为囊胚早期、中期和晚期,原肠阶段分为原...     

患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定

从患病细鳞鱼(Brachymystax lenok)的病变组织处分离到1株致病菌,经过分离培养,生化鉴定,16 S rRNA序列分析和人工感染实验确定该病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。采用20种药物进行药敏分析,结果显示:分离菌株对阿米卡星、哌拉西林、恩诺沙星等9种抗生素敏感;对环丙沙星、诺氟沙星等4种抗生素中度敏感;对卡那霉素、青霉素、氨苄西林等7种抗生素耐药。     

河川沙塘鳢胚胎发育过程中可溶性蛋白组成及含量的变化

利用显微镜观察了河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)胚胎的发育过程,并采用生物化学方法测定、分析了河川沙塘鳢胚胎发育过程中可溶性蛋白的组成及含量。结果显示,可溶性蛋白组成及含量变化与其胚胎发育的过程密切相关。在受精卵期,可溶性蛋白主要是相对分子质量为116 000、100 500的卵黄蛋白。随着胚胎发育的进行,可溶性蛋白的组成由高分子的蛋白向低分子的蛋白转化,其相对分子质量为97 250、86 000、68 000、38 000、26 000等。在胚胎发育后期,高分子的蛋白进一步减少,而低分子的蛋白进一步增加。可溶性蛋白的含量随着胚胎的发育总体呈下降的趋势。     

河川沙塘鳢不同家系生长性能的比较及优良亲本选择

采用巢式设计,对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)四个不同地理群体(建德、当涂、射阳和苏州)进行群体内和群体间杂交,构建了34个全同胞家系,进而分析了不同家系子代的生长性状指标,方差分析和多重比较结果显示:不同家系的子代在生长性能上差异显著。其中,在整个生长测量过程中,F36、F35、F29、F16和F1号等家系无论是全长还是体重都表现较优的生长速度和增长量,生长优势明显,由此可判断F36、F35、F29、F16和F1等家系为优秀家系,可作为该品种进一步选育的基础群体。对34个河川沙塘鳢家系亲本来源与子代生长性能的相关性分析结果表明,生长性能良好的河川沙塘鳢家系中,父本来源于建德群体的居多,母本来源于当涂群体的居多。可见建德群体适合作父本,当涂群体适合作母本。     

河川沙塘鳢致病真菌的特性及分子生物学鉴定

从发病河川沙塘鳢(Odontobutis potamopgila(Gunther))的亲鱼及卵上取病灶样品,经培养分离得到相同的一株水霉菌FD07,对其形态、生理特性进行研究,并进行ITS rDNA分子鉴定.结果显示:该菌的最适生长温度为20℃,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)上生长良好,主要形态特征是菌落结构...     

河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及其杂交子代的微卫星分析

使用15对微卫星引物对河川沙塘鳢（ Odontobutis potamophila,♀）、鸭绿沙塘鳢（ O.yaluensis,♂）及其河川沙塘鳢（♀）×鸭绿沙塘鳢（♂）杂交子代3个群体进行扩增,研究3个群体的分子遗传机制,结果表明：（1）15对微卫星引物中OP215 a和OP110 a在鸭绿沙塘鳢中呈现单态性,其余的13对在3个群体中均能良好扩增;OP10a、 OP23a和OP46a可鉴别河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢及杂交子代3个群体。（2）3个群体的平均多态信息（ PIC）含量分别为0.6450、0.5375、0.5183;平均有效等位基因数（ Ne）分别为4.2977、3.6188、2.7793;平均观测杂合度（Ho）分别为0.6334、0.5920、0.6290。（3）双亲遗传分化显著,等位基因均来自亲本群体,基本符合孟德尔遗传定律,推断杂交子代为两性融合生殖,是真正意义上的杂交种。（4）杂交子代与河川沙塘鳢和鸭绿沙塘鳢的遗传距离分别为1.0036、0.8361,前者大于后者,表明杂交子代与两亲本的遗传差异是不对等的,而是偏向父本一方,系统进化树也支持这一观点。     

河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程中蛋白酶活性的变化

采用生物化学方法测定和分析了河川沙塘鳢(Odontobutis potam ophila)胚胎、仔鱼发育过程中胃蛋白酶、胰蛋白酶的活性及其变化。结果显示,在胚胎发育初期,其胃蛋白酶的活性一直很低,在孵化前期,其胃蛋白酶的活性增高,之后继续升高,在孵出后5 d的仔鱼,其胃蛋白酶的活性达到最高。在胚胎发育初期,其胰蛋白酶活性相对较高,在眼黑色素出现期时明显升高,而在孵化前期时再次升高,孵出后5 d的仔鱼,其胰蛋白酶的活性亦达到最高。这也说明在河川沙塘鳢的胚胎、仔鱼发育过程中,其蛋白酶的活性总体呈上升的趋势。     

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快...     

河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程中脂类含量及脂肪酸组成的变化

采用生物化学方法测定和分析了河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)胚胎、仔鱼发育过程中脂类的含量及脂肪酸的组成。结果显示,随着胚胎和仔鱼的发育,其总脂的含量呈下降趋势,饱和脂肪酸(SFA)的含量亦呈现出下降趋势,单不饱和脂肪酸(MUFA)的含量在胚胎期保持稳定、在仔鱼期下降,而多不饱和脂肪酸(PUFA)却呈现出不断增长的趋势。在整个胚胎和仔鱼发育过程中,平均含量最高的脂肪酸依次是C16∶0、C18∶1n-9、C18∶0、C16∶1、C22∶6n-3(DHA)和C20∶5n-3(EPA)。结果表明:河川沙塘鳢在胚胎和仔鱼发育过程中有消耗饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸,而保存n-3系列和n-6系列的高度不饱和脂肪酸的趋势,饱和脂肪酸被作为胚胎期能量代谢的主要来源,单不饱和脂肪酸被作为仔鱼期能量代谢的主要来源,而C18∶3n-3(亚麻酸)和C18∶2n-6(亚油酸)被用于合成DHA、EPA和C20∶4n-6(AA)。     

河川沙塘鳢线粒体基因组重排机制及分子标记筛选

采用引物步移法PCR扩增,获得全长为16846 bp的河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)线粒体全基因组DNA(mt DNA),并对其基因结构、重排机制及在系统发育中的应用进行了分析。研究结果:(1)河川沙塘鳢mt DNA由37个基因和1个非编码控制区组成;除ND6和8个t RNA外,其他基因都编码在重链(H)上;t RNA基因因发生滑移重排(shuffling),将经典的线粒体基因组HSL(t RNAHis–t RNASer–t RNALeu)排列变成了SLH(t RNASer–t RNALeu–t RNAHis)排列,造成在t RNALeu与t RNAHis、ND4与t RNASer之间分别插入了320 bp和42 bp的两个"匿名区"。(2)检测的112种鲈形目(Perciformes)鱼类中,仅有13种(11.61%)发生了mt DNA基因重排现象,而沙塘鳢属的中华沙塘鳢(O.sinensis)、平头沙塘鳢(O.platycephala)与河川沙塘鳢的基因重排位置一致,揭示其可能是沙塘鳢属鱼类进化过程中的一个重要分子"标签"。(3)筛选得到的两个分子标记ND4和ND5基因,适合用于虾虎鱼亚目(Gobioidei)鱼类科阶元水平的系统发育关系的重建。     

河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila) Mn-SOD基因的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)和实时荧光定量PCR等技术,对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)的Mn-SOD基因进行了克隆和表达模式分析.结果显示,克隆得到的河川沙塘鳢Mn-SOD基因的cDNA序列全长为1008 bp,包括678 bp的开放阅读框(ORF),15 bp的5'UTR区和315bp的3'UTR区,并且具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和31 bp的PolyA尾巴,推测该序列共编码225个氨基酸.该基因包含Sod Fe_N(28-109)与Sod Fe C(116-219)2个保守的结构域,此结构与其他物种极为相似,表明该基因在物种进化中比较保守.与已知物种Mn-SOD进行同源性比对发现,河川沙塘鳢Mn-SOD氨基酸序列与条石鲷(Oplegnathus fasciatus)和线鳢(Channa striata)相似性最高,均为90.3％.采用qRT-PCR技术检测了Mn-SOD基因在河川沙塘鳢8个组织(肾、肝、肌肉、脑、脾、鳃、眼、心脏)和8个发育时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1d、出膜后3 d)的表达情况.在检测的8个组织中都有Mn-SOD基因的表达,肌肉中的表达量最高;胚胎到仔鱼的8个发育时期都有Mn-SOD基因的表达,桑椹胚期表达量最高.在急性NaNO2胁迫处理后,河川沙塘鳢肝组织Mn-SOD基因的mRNA表达呈先升高后降低的趋势.而鳃组织Mn-SOD基因的mRNA表达呈先降低后升高再降低的趋势.研究表明,Mn-SOD很可能在对抗NaNO2胁迫引起的氧化损伤中起重要作用,这将为控制河川沙塘鳢的人工育苗及养殖条件提供有价值的参考资料.     

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物（ECP）。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量（LD50）为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。     

河川沙塘鳢GHR和IGF-2基因克隆及mRNA的时序表达

生长激素/胰岛素样生长因子-轴(growth hormone/insulin-like growth-axis,GH/IGF-轴)是调控鱼类生长的主要内分泌轴线。为探讨生长相关基因GHR、IGF-2对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)生长发育的调控机制,采用cDNA末端快速扩增(RACE)和实时荧光定量PCR等技术,对河川沙塘鳢的GHR、IGF-2基因进行了克隆和表达模式分析。研究结果显示:河川沙塘鳢GHR基因的cDNA全长序列为2 179 bp,开放阅读框为1 830 bp,共编码609个氨基酸,IGF-2基因的cDNA全长序列为1 586 bp,开放阅读框642 bp,共编码213个氨基酸。采用qRT-PCR方法检测了GHR、IGF-2基因在9个不同组织(脑、肝、心、肌肉、脾、肠、性腺、鳃、肾)和8个胚胎不同发育时期(受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后1 d、出膜后3 d)的表达情况。结果表明:IGF-2和GHR基因在所检测的9种组织中均有表达,其中以肝脏、肌肉、性腺、脑中的表达量较高,在胚胎发育阶段GHR和IGF-2基因表达呈先上升后下降的趋势,在原肠胚期表达量较高,表明其在胚胎发育过程中发挥重要作用。qRT-PCR进一步比较了雌、雄河川沙塘鳢GHR和IGF-2基因在不同生长发育阶段(90、150、210、270、330 d)脑、肝、肌肉mRNA的表达量,结果表明:各时期雄鱼GHR和IGF-2基因在肝组织中表达量均显著高于雌鱼,肌肉和脑GHR基因mRNA的表达量则无显著差异。而IGF-2基因则仅在雌、雄鱼210 d的脑和150、210 d的肌肉存在显著性差异,推测肝GHR和IGF-2基因mRNA表达的雌雄差异是河川沙塘鳢雌雄生长差异的主要原因之一。     

湖州河川沙塘鳢群体线粒体DNA cyt b基因序列的遗传多样性分析

河川沙塘鳢具有肉鲜味美,细嫩可口的特点,营养价值与经济价值颇高,是一种极具发展潜力的水产养殖品种,对野生和人工繁育河川沙塘鳢的遗传结构进行检测分析,可为选育和种质保护提供参考资料。本文对湖州河川沙塘鳢(钟管野生群体及八里店养殖群体)的线粒体细胞色素b(cyt b)基因全长进行扩增和测序,并应用生物信息学软件与Gen Bank中太湖、鄱阳湖和巢湖3个群体的数据进行比较。河川沙塘鳢cyt b基因全长1141 bp,4种碱基在所得序列中平均含量为A(26.8%)、G(13.8%)、T(28.0%)、C(31.4%),序列分析显示,cyt b基因序列中变异位点378个,占分析位点的44.26%,含有241个简约信息位点,平均转颠换比值(TS/TV)为0.76。在5个群体138个个体中共检测到75个单倍型,平均单倍型多样性为0.869～1.000,核苷酸多样性为0.01431～0.03848。各群体间遗传距离差异较大(0.01493～0.05868),其中八里店与钟管群体的遗传距离最小(0.01493),而鄱阳湖与巢湖群体的遗传距离最大(0.05868),与构建的聚类图分析结果一致。群体中性检验...     

2株亚东鲑源气单胞菌的鉴定及其致病性与药敏特性分析

亚东鲑(Salmo trutta fario)是西藏地区重要的冷水性经济鱼类之一。为明确亚东鲑暴发性死亡的原因, 对从患病亚东鲑体内分离得到的 2 株优势细菌 B1、A3-2 进行种类鉴定、毒力基因检测、动物回归感染、耐药基因检测和药敏试验。结果显示, 2 株优势细菌鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) B1 和温和气单胞菌(Aeromonas sobria) A3-2。杀鲑气单胞菌 B1 对亚东鲑具有较强的致病性, 而温和气单胞菌 A3-2 对亚东鲑未表现出致病性。杀鲑气单胞菌 B1 携带有 10 种毒力基因: 外毒素(AerA、Act 和 hly 基因)、胞外酶(gcat、ahyB 和 Lip 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT、aopP 和 ascF-G 基因)、鞭毛(Fla 基因); 温和气单胞菌 A3-2 携带有 5 种毒力基因: 外毒素(Act 和 Alt 基因)、胞外酶(gcat 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT 和 aopP 基因)。杀鲑气单胞菌 B1 对头孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、环丙沙星、四环素、链霉素等 21 种抗菌药物敏感, 仅对万古霉素耐药; 温和气单胞菌 A3-2 对头孢曲松、氟苯尼考、环丙沙星、吡哌酸、四环素、链霉素等 17 种抗菌药物敏感, 对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑、复方新诺明、万古霉素等 6 种药物耐药。杀鲑气单胞菌 B1 含有 AmpC、gyrA 和 parC 等 3 种耐药基因; 温和气单胞菌 A3-2 含有 AmpC、gyrA、parC 和 tetE 等 4 种耐药基因, 2 种气单胞菌的耐药基因检出结果与耐药表型基本一致。杀鲑气单胞菌 B1 是引起亚东鲑暴发性死亡的重要病原菌, 本研究为亚东鲑养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、疫苗研制和疾病防控提供了基础数据。     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾■(Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定...     

泗洪地区克氏原螯虾病原维氏气单胞菌鉴定及致病性分析

为了探究江苏省泗洪县多家养殖场克氏原螯虾(Procambarus clarkii)出现暴发性死亡的病因,本研究以濒死的克氏原螯虾进行病原检测分析,从濒死虾肝胰腺中分离到优势生长菌(菌株编号CPA2020),经对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及gyrB基因同源性与系统发育分析,结果表明引起克氏原螯虾暴发性死亡的病原为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii),人工感染实验结果表明分离菌CPA2020对克氏原螯虾具有较强的致病性,LD₅₀为6.31×10⁵ CFU/mL。组织病理学观察发现克氏原螯虾的肝胰腺与肠道组织出现严重的病理损伤,肝细胞裂解,空泡化严重,部分肝细胞坏死,肠壁结缔组织萎缩,皱嵴减少,肠上皮细胞坏死,与自然患病虾的病理变化相同。毒力基因检测表明分离菌CPA2020携带lip、hly、flgN、ompA、flgM、flaH、aha和flgA 8种毒力基因。此外分离菌CPA2020可分泌卵磷脂酶、明胶酶和溶血素。耐药谱测定结果显示,该菌对链霉素、万古霉素、环丙沙星等12种药物耐药,对头孢唑林、克拉霉素等9种药物中介,对...     

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2 和Mg2 可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。