百合鳞片总RNA提取方法的比较

为了筛选出适合百合鳞片的总RNA的提取方法,本研究以东方百合品种Siberia的鳞片为材料,比较了Trizol法、改良Trizol法、RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取RNA的效果。结果表明:Trizol法、改良Trizol法及RNA plant plus Reagent提取试剂盒均不能提取到完整的RNA;离心柱型植物总RNA提取试剂盒存在DNA污染;改良CTAB法能有效去除多糖,28S条带的荧光亮度是18S条带的1.5～2倍,D260/D280值都在1.9～2.1之间,D260/D230值大于2,两个样品的平均得率分别为103.57μg/g和119.21μg/g,说明此方法适合百合鳞片RNA的提取。RT-PCR结果扩增出了特异性条带,说明改良CTAB法从百合鳞片中提取的RNA质量高、完整性好、产率高,完全可以用于后续的分子生物学实验。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明：以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究.结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA.设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带.构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%.用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据.     

马铃薯X病毒的分子生物学方法检测探究

根据马铃薯X病毒的基因序列,合成了1对特异性引物,从感染PVX的马铃薯病叶组织中提取出总RNA,进行cDNA合成和PCR扩增,得到一条长度约为101 bp的特异性PCR扩增产物.为马铃薯PVX的检测用分子生物学手段提供了一套快速、简便的RNA提取、PCR扩增的基础参数.     

栀子高质量总RNA的提取

利用改进的高盐高pH值法和EASYspin植物RNA快速提取试剂盒,从富含次生代谢产物的栀子叶片和果实中提取总RNA。用紫外分光光度法和1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量,0.7%非变性琼脂糖凝胶电泳检测反转录产物质量,利用RT-PCR反应检测反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明,高盐高pH值法提取的栀子果实总RNA,试剂盒法提取的栀子叶片总RNA产量均较高,28S和18S条带清晰,28S条带亮度是18S条带的2倍,且A260/A280在1.9~2.0;以提取的RNA为模板反转录的cDNA长度范围较广(250~5000 bp);上述反转录获得的cDNA均能够成功用于60S核糖体蛋白L18A基因片段的扩增。综上所述,利用高盐高pH值法提取栀子果实总RNA、利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取栀子叶片总RNA,效果最好。本研究成功建立了从栀子果实和叶片中提取高质量总RNA的方法。     

杏叶片与果实总RNA提取方法研究

以杏叶片及幼果为材料,分别从操作耗时、RNA质量和产量等方面比较了CTAB法、改进CTAB法、SDS法、改进SDS-酚法和RNA提取试剂盒Trizol等5种不同的RNA提取方法。结果表明：5种方法均能从幼嫩叶片中提取到总RNA;经电泳检测,28SrRNA和18SrRNA两条主带清晰,A260/A280大于1.8。在叶片RNA提取过程中,改良的CTAB法及Trizol法能获得高质量的RNA,产量也分别达到395.21和839.25μg/g。其中改良SDS以及改良CTAB能更有效减少果实RNA的提取中酚类物质和多糖等杂质的影响,获得质量高的总RNA。每种方法提取的叶片和果实的RNA经反转录后形成cDNA,并进行RT-PCR扩增,成功扩出看家基因泛素蛋白UBQ片段,说明了RNA能够很好地应用于文库构建、基因克隆等研究。     

甘蔗种质总RNA提取方法的研究

甘蔗是重要的糖料及能源作物之一。甘蔗种质RNA的提取是甘蔗分子生物学研究的前提。本实验是以成熟甘蔗的叶片为材料,通过对前人的植物RNA提取方法进行改良,寻求最佳的甘蔗总RNA提取方法。通过改良最后得到的异硫氰酸胍法Ⅲ具有成本低、操作简单、省时等特点。用该法提取得到的甘蔗总RNA经琼脂糖凝胶电泳可获得28S、18S和5S rRNA3条带,并且28S rRNA的亮度大于18S rRNA的亮度。表明该方法提取的RNA完整性好,纯度高。另外对所得部分甘蔗种质的总RNA进行RT-PCR检测,可特异扩增出目标片段,说明用异硫氰酸胍法Ⅲ提取的甘蔗种质总RNA,可以直接用于后续的分子生物学试验。     

牡丹种子总RNA提取方法比较

采用CTAB法、Trizol法及改进的RNA提取试剂盒方法提取牡丹种子的总RNA,比较三种方法的优劣,从而筛选出一种适合于牡丹种子高质量RNA的提取方法。结果表明,以RNA提取试剂盒为基础,当每管样品是25 mg(700μL裂解液)时,六管合一管过吸附柱的方法操作简单,且能够有效地去除牡丹种子中脂肪、多糖、多酚等代谢物质,从而提取出高质量的RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该法提取的RNA完整性好,紫外分光光度计检测其OD260/OD280比值为2.03。而且,该法提取得到的RNA被成功应用于荧光定量PCR表达分析等后续的分子生物学研究。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

本研究采用试剂盒和Total试剂两种方法从马铃薯叶片和茎秆中提取总RNA,同时设计了一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系,依据马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,并运用两种RT-PCR反应体系对染病的马铃薯进行病毒检测,结果与报道的这五种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对, 表明扩增的五种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。两种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。     

朝鲜百合鳞茎诱导及再生体系建立

野生百合种类稀少,个别种类是中国特有,植物离体快速繁殖是保护稀少濒危百合种的有效方法,本研究为了探究一种朝鲜百合快速繁殖的方法。本研究以野生百合朝鲜为试材,以MS培养基为基础培养基,附加不同种类和浓度的植物生长调节物质（6-BA,NAA）诱导丛生芽及再生植株。以朝鲜百合的鳞茎为外植体,确定鳞茎的最佳消毒时间、影响鳞茎芽诱导的最佳激素组合以及不同激素对鳞茎芽增殖的影响。结果表明：最佳灭菌时间为0.1% HgCl消毒10 min;由于内源激素比例不同,鳞茎诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;最佳继代培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L。     

兰州百合鳞瓣气培繁育小鳞茎技术研究

为解决百合母籽繁殖方法单一、品质退化的问题,以兰州百合为试验材料,研究了不同消毒方法对百合鳞瓣腐烂率的影响,不同气培厚度及不同鳞瓣部位对小鳞茎繁殖的影响。结果表明：0.1%的高锰酸钾浸泡10 min,气培15天后鳞瓣的腐烂率最低为21.25%,比对照低51.42%;用该消毒方法处理百合鳞瓣,60天后,外瓣4.0 cm处理的繁殖系数最高,为2.41,但是外瓣较内瓣易腐烂。百合气培繁育小鳞茎,外瓣较内瓣适宜气培,气培厚度与繁殖系数成反比。     

叶面施肥对百合 ‘木门’ 植株和鳞茎生长的影响

探索不同叶面施肥配方对‘木门’植株各器官生长发育的影响,为种球繁育和切花生产实现优质高效栽培提供依据。在辽宁省大田栽培条件下,采用2因素随机区组试验方法,研究了叶面施肥对百合木门的植株生长特性及鳞茎产量的影响。叶面喷施维生素B1可显著增大百合植株的茎秆粗度、鳞茎产量、茎生根数量和长度,喷施尿素对增大叶面积作用显著。维生素B1与尿素配合喷施可有效改善百合植株的生长性状,提高百合鳞茎的产量,其中以维生素B1和尿素的配合喷施次数均为3次时效果最佳,百合鳞茎产量均达到最高值,较对照增加40.9%。建议在种球生产中,尿素3次,维生素B1喷施3次。     

百合种球活力改良外源技术研究进展

为了提高百合种球活力研究的系统性,文章从种球活力外源改良技术研究的有关进展入手,包括种球品质复壮技术、采后处理技术和播前处理技术等三大方面,系统阐述组织培养、脱毒、扦插、种球更新、提纯复壮、冷藏处理和播前处理的理化调节技术等应用进展,认为这些外源技术的应用直接受品种、类型、状态、环境、处理等因素影响,改良效果存在差异,建议百合种球外源改良技术的研发应用宜依托种质创新、种球活力生理等基础研究,形成较为完备的种球品质精准改良技术的研发体系,以推动中国百合种球国产化繁育工作健康发展。     

亚洲百合鳞茎休眠过程中需冷量的研究

以亚洲百合（白天使,普瑞头）为材料,研究了不同低温及不同时间对百合鳞茎解除休眠的效应和百合鳞茎解除休眠的最适需冷量,结果表明：亚洲百合打破休眠的最有效温度为5℃,15℃以上对打破休眠无效,仅白天使对-2℃低温有一定感应, 对于0℃、10℃低温,白天使经0℃处理打破休眠效率高于10℃,普瑞头则与之相反;两种百合鳞茎解除休眠的最适需冷量分别为：白天使,1200C.U,普瑞头,840C.U。     

百合鳞茎形成的生理生化研究

为研究建立高效稳定的百合鳞茎形成体系,以自繁的东方百合(Lilium Oriental Hybrid)品种‘索蚌’为材料,研究SOD、POD、CAT 3种抗氧化酶的活性变化以及可溶性蛋白和可溶性糖含量变化对百合鳞茎发生过程中的生理生化机制。结果表明,在百合鳞茎发生发育过程中,SOD与POD活性升高,而CAT酶活性的变化与SOD、POD活性变化趋势正好相反;可溶性蛋白累积和可溶性糖变化与百合鳞茎形成密切相关。因此,在百合鳞茎形成过程中,SOD、POD、CAT酶活性变化与鳞茎诱导及其发育密切相关,其中SOD、POD酶在百合鳞茎形成的过程中起着主导作用;可溶性糖和可溶性蛋白质累积变化为百合鳞茎形成提供物质和能量基础。     

百合发育过程中鳞茎淀粉含量及SP活性变化

为探讨百合鳞茎内淀粉含量与淀粉磷酸化酶(SP)活性变化的关系,以亚洲百合和兰州百合为试材,对鳞茎发育过程中母鳞茎、新鳞茎内淀粉含量以及SP活性的变化进行测定。结果表明,2种百合母鳞茎淀粉含量展叶期前均呈下降趋势,而后迅速升高,展叶后40天达到最大值,之后2种百合淀粉含量均下降,亚洲百合下降趋势较为明显;新鳞茎淀粉含量总体呈上升趋势,其中亚洲百合新鳞茎淀粉含量在枯萎期达到最大值,而兰州百合在植株半枯期达到最大值。百合发育过程中淀粉的积累与SP的含量呈正相关,发育过程中2种百合淀粉含量的变化趋势与SP变化趋势基本一致,但鳞茎内淀粉含量最大值与SP活性高峰并非同步出现,说明SP与百合鳞茎淀粉合成有关,却非参与合成淀粉的唯一酶。     

Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体

为获得适合转化百合的双价RNAi表达载体,以感病百合叶片的总RNA为模板,分别扩增400 bp左右的LSV和LMoV CP基因。通过重叠延伸PCR技术获得长约800 bp的LSV-LMoV融合基因。利用Gateway技术,通过BP反应及LR反应将LSV-LMoV融合基因克隆到双元载体pH7GWIWG2(Ⅱ),成功构建了含两种病毒基因的RNAi表达载体pH7GWIWG2(Ⅱ)-LSV-LMoV。将构建好的双价表达载体导入农杆菌EHA105,PCR和测序表明所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致。     

亚洲百合种球冷藏过程中生理生化变化

4种亚洲百合种球采后在冷藏(-1.8～-2.1℃,湿度80%～85%)条件下生理生化变化及贮藏效果进行研究与观察.结果表明,其中3种百合种球在贮藏过程中葡萄糖含量略有上升,过氧化物酶活性随贮藏天数的增加而明显下降,其贮藏后栽培产花率达95%以上.     

RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。