抗独特型单克隆抗体在鸡中诱导的抗新城疫病毒保护性免疫——新城疫单克隆抗独特型疫苗研究(Ⅲ)

用AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id两株新城疫病毒(NDV)的抗独特型单抗(MAb_2)分别免疫接种一组(18只)无HI抗体鸡,并以一组(7只)Lasota苗常规免疫鸡和一组(12只)不免疫的易感鸡分别作为免疫阳性和阴性对照。在两株MAb_2末次免疫后8天,用微量血凝抑制(HI)试验检测了4组鸡的血清中HI抗体水平。结果:两株MAb_2和Lasota苗免疫的鸡全都产生了HI抗体,非免疫鸡均未测到HI抗体。AFE_8Id_(16-6)免疫鸡的HI滴度为1～5log_2;ALA_(15-6)Id免疫鸡的HI滴度为1～4log_2;Lasota苗免疫鸡的HI滴度高达7～10log_2。在HI抗体检测后2天,用100LD_(50)F_(48)E_8株NDV强毒攻击4组鸡,隔离观察10天,AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id免疫鸡的保护比值分别为17/18和10/18,Lasota苗免疫鸡保护比值达7/7,而非免疫对照鸡在攻毒后6天全部死亡。试验结果证明,上述两株MAb_2是NDV保护性抗原的模拟物,在多次注射后可诱导鸡产生抗NDV的血凝抑制抗体,并能使鸡抵抗NDV强毒的人工感染。因此,这两株抗独特型单抗,尤其AFE_8Id_(16-6)有希望用作新城疫抗独特型疫苗。     

抗新城疫病毒血凝素中和性单克隆抗体的研制和免疫生物学特性鉴定——新城疫病毒的单克隆抗独特型抗体疫苗研究之一

作者以新城疫病毒(NDV)的强毒株F_(48)E_8为免疫抗原。应用淋巴细胞杂交瘤技术。获得6株抗NDV血凝素的中和性单克隆抗体,分别命名为F_4、FE_8、F_(14)、F_(14),FD_(12)和F_(32)。这6株单抗对NDV都表现出高度的血凝抑制(HI)活性和中和能力。其中FE_8和F_4单抗的HI效价分别达1:2~(17)和1:2~(16),鸡胚内中和效价分别达10~(-5)和10~(4.8)。这些单抗的特异性强,仅与NDV发生反应,而与感染家禽的常见病毒如传染性腔上囊炎病毒(IBDV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)均无交叉反应。在鸡体保护试验中,1ml 1:160倍稀释的FE_8或F_4腹水单抗均能使所试小鸡抵抗NDV强毒的攻击。上述结果表明,FE_8和F_4单抗不仅能为NDV的单克隆抗独特型抗体研制提供一种理想的免疫原(单克隆独特型抗体,Ab_1)。而且可用于新城疫的紧急预防。     

鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定

采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒(NDV)标准毒株F48E8,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体,旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞,建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,筛选获得14株分泌抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,其单克隆抗体腹水IPMA效价均在0.50×10-2~2.56×10-5(F48E8株和La Sota株)。血凝抑制试验(HI)结果表明,单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性,其HI效价在(6~12)log2(F48E8株)和(9~11)log2(La Sota株)。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体5F2和13A5对F48E8株和La Sota株均有明显的病毒中和活性,中和效价分别为1∶400~1∶800和1∶25。夹心ELISA结果表明,单克隆抗体5F2识别NDV HN蛋白,13A5识别F蛋白。综上,成功制备了具有中和活性的NDV单克隆抗体(5F2和13A5)。     

ClassⅠ新城疫病毒单克隆抗体的制备

本试验以纯化的新城疫病毒(NDV)弱毒株D58为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠,分离脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,经多次ELISA鉴定和血凝抑制试验(HI)筛选和亚克隆培养,获得了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞并制备了单抗。经鉴定,4株单抗均有ELISA效价,其中1株单抗有中和活性和HI活性,只与ClassⅠNDV反应,与ClassⅡNDV不反应。该单抗与不同群NDV反应的差异性为NDV的鉴别诊断和不同毒株抗原差异性研究奠定了一定基础。     

哈尔滨地区新城疫病毒的分离鉴定及部分生物学特性研究

2012年4月~2014年4月,从哈尔滨市18个地区鸡场中疑似新城疫(ND)发病鸡群体内分离到6株具有血凝活性的病毒,经血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)和电镜观察证实了6株病毒为新城疫病毒(NDV)。经蚀斑纯化后进行生物学特性的研究显示,其鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为37.2~60.8 h、1.71~1.80,说明该病毒属于NDV强毒株或中强毒株。     

复方糖苷抗新城疫病毒感染作用

采用2种方法研究了复方糖苷抗新城疫病毒(Newcastle disease Virus,NDV)感染作用。一是鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)培养法,通过观察NDV CPE的形成及测定CEF OD值的变化,计算病毒抑制率等指标,综合评价复方糖苷在细胞水平上抗NDV作用,并从直接灭活病毒、阻断病毒吸附与生物合成及释放等环节,探讨了复方糖苷的抗NDV途径。二是将复方糖苷稀释成1 200,1 000,800,600,300μg/m L 5种浓度与100 EID50 NDV液混合后接种9日龄SPF鸡胚,于72 h后统计鸡胚的存活数并测定尿囊液血凝效价(HA),依此判定复方糖苷在鸡胚内抗NDV作用。结果表明:随着药物浓度的增加CPE的特征逐渐减弱,OD值明显升高,病毒抑制率增大,当复方糖苷质量浓度为600μg/m L时对NDV具有显著的直接杀灭与阻断吸附作用。HA在1 200,1 000μg/m L时均为0。表明复方糖苷具有显著的抗NDV感染作用。     

表面活性素体外抗新城疫病毒活性研究

研究了表面活性素(Surfactin)的体外抗新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) lasota株效果.观察表面活性素的细胞毒性、对NDV直接灭活作用、抗NDV吸附作用及对NDV生物合成抑制作用.结果表明生物表面活性素对鸡胚成纤维(Chicken Embryo Fibroblasts,CEV)细胞的TD50和TD0分别为62.5、16.125μg/ml;具有直接灭活NDV及抗其吸附效果,可剂量依赖性抑制NDV生物合成.     

新鱼腥草素钠增强NDV LaSota疫苗免疫作用研究

用新城疫病毒(NDV) LaSota株弱毒活疫苗接种1日龄非免疫健康肉雏鸡的同时,以新鱼腥草素钠为免疫佐剂按不同剂量颈部皮下注射,以生理盐水为对照;二次免疫后第7、14、21、28天分别测定各组动物的抗NDV血凝抑制抗体和外周血CD4 /CD8 淋巴细胞比值.结果表明: 新鱼腥草素钠对提高鸡体抗NDV血凝抑制抗体效价和外周血CD4 /CD8 淋巴细胞比值都有一定作用,与对照组差异显著(P<0.05),且这种作用与给药剂量有关.另外,新鱼腥草素钠对细胞免疫的影响早于对体液免疫.     

消毒液对新城疫病毒的杀灭效果

应用血凝试验检测“天刃”牌消毒液(pH值为6.5和7.5)对新城疫病毒(NDV)的杀灭效果。将2种pH值不同的消毒剂做1∶10稀释,与1∶500的DNV等量混合,在体外分别作用2、10min后,进行鸡胚尿囊腔接种,培养72h,收集鸡胚尿囊液测定血凝价以判断消毒剂对NDV的杀灭效果。结果表明:2种消毒剂在1∶10稀释的情况下对NDV杀灭效果明显。     

新城疫野毒株的分离鉴定

2000年春从河南省不同地区的鸡群中分离到2株新城疫病毒，该二毒株经鸡胚传代培养，血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)，鸡胚平均死亡时间(MDT)试验，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定，6周龄非免疫鸡静脉接种指数(IVPI)测定及空斑试验等生物学特性试验，结果表明该二毒株为新城疫强毒株。     

抗新城疫病毒中和性单克隆抗体研制和特性分析

应用杂交瘤技术,以纯化的NDV-lasota为免疫原结合间接ELISA筛选到了24株抗NDV单抗,其中3 株(McAb-14、McAb-18和McAb-21)具有中和活性,并与其血凝抑制效价具有很大的相关性。McAb-18和 McAb-21的免疫球蛋白亚类都属于IgG2a;McAb-14为IgG2b。特异性鉴定结果表明:3株抗NDV的单抗均不与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒等发生交叉反应。用这3株中和单抗的任2种混合液对鸡进行了被动免疫治疗和免疫预防试验,结果表明:McAb-14 McAb -18组合的免疫预防和治疗效果最好。     

新城疫病毒广西强毒株的分离与鉴定

从广西某规模化鸡场两个鸡群病死雏鸡中分离到2株有血凝性的病毒，这2株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制和中和，经过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、血清中和试验和RT-PCR检测结果，确定为新城疫病毒。2株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为52和54h，脑内致病指数(ICPI)分别为1．975、1．875；鸡胚半数致死量(ELD50)分别为：10^-9.38／0.1mL、10^-9.68／0．1mL，实验结果证明该2株病毒为新城疫病毒强毒株。     

3种不同禽源副粘病毒抗原相关性研究

通过交叉血凝抑制试验和微量交叉中和试验测定鹅源副粘病毒(MQG株)、鸭源副粘病毒(Lg株)和新城疫标准毒(F48E8株)3种不同禽源副粘病毒的血清学相关性。结果显示3种病毒之间的R值很小(R<0.2),抗原相关性较低,表明3种不同禽源副粘病毒的抗原相关性有较大差异。     

鸡新城疫强度株的分离鉴定与免疫保护试验

从河北省保定地区发病鸡群中分离到2株有血凝性的分离物,其血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS 76所抑制,表明2株分离物均为新城疫病毒。对2株NDV的毒力指数(MDT、IC-PI、IVPI)测定结果显示:MDT分别为40.8 h和53.7 h,ICPI分别为1.96和1.86,IVPI分别为2.89和2.72,表明2株NDV均为新城疫强毒株。采用分离的HBW株制成油乳剂灭活疫苗,分别以HBW株和LaSota株的灭活苗免疫试验鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果显示:(1)分离株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫组鸡的抗体效价相差不明显,2组的升降规律也基本一致。(2)分离株灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击可给予100%的保护,Lasota灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击不能给予100%的保护。说明NDV不同基因型毒株间的毒力和抗原性有一定的差异。     

新城疫分离株与La Sota疫苗交叉免疫保护性研究

用新城疫(ND)分离强毒油佐剂灭活苗和NDV La Sota油佐剂灭活苗分别免疫带有新城疫母源抗体的雏鸡,免疫后每7d采集血清,用微量血凝抑制试验方法检测HI抗体.并于免疫后第21、28、35 d用鸡新城疫分离毒和NDV F_(48)E_9分别进行攻毒试验,结果显示,免疫鸡的HI抗体水平没有大的差异,分离毒株灭活苗对鸡新城疫强毒感染的免疫保护效力优于La Sota灭活苗.     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株建立及免疫原性测定

在建立了布氏杆菌单克隆抗体细胞株的基础上,筛选具有强保护作用的单抗细胞株A7免疫BALB/C鼠,并进行细胞融合.用竞争抑制ELISA法筛选出5个强阳性孔,经克隆化培养后首次建立了9个布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株.其中,F9株传25代后及液氮冻存复苏后仍能稳定地产生高效价的抗独特型抗体.其IgG类型鉴定为IgG2a,并证实具有抗原“内影象”.以鼠红细胞为载体将抗独特型抗体吸附其表面进行小鼠免疫试验,检测结果表明该抗独特型抗体具有良好的免疫原性,能诱导免疫小鼠产生相当效价抗布氏杆菌抗体(Ab3).     

15株NDV地方株的分离鉴定与生物学特性

从1998~2002年河南省洛阳地区代表性新城疫发病禽群中分离鉴定了15株新城疫病毒(NDV),并对其生物学特性进行了研究。结果表明,15株NDV均呈现良好的血凝活性和特异的血凝抑制特性;对鸡胚的致病作用可被新城疫阳性血清所抑制;对鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT),1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉内接种的致病指数(IVPI)的测定证实,LD-6-01和LR-2-00株是弱毒株,其余均为强毒株;弱毒株的血凝素热稳定性较好,属慢速血凝解脱型;强毒株的血凝素热稳定性差,属快速或中速血凝解脱型;所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大。对HI抗体为6log2的12日龄雏鸡攻毒试验结果表明,15个分离株中2个弱毒株可得到100%保护;13个强毒株中,LG-1-99,LR-1-98,LD-4-01和LD-3-00得到了70%~90%的保护,而其他9个分离株(LD-1-98,LD-2-99,LD-5-01,LD-7-02,LR-3-02,LW-1-02,LG-2-00,LA-1-99和LE-1-01)基本上得不到保护(0~20%),但所有得不到保护的试验组鸡的发病死亡时间均明显向后推迟。     

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体特性的研究

试验采用琼脂免疫双扩散 ,酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,病毒中和试验和 Western-blotting试验对 13株单克隆抗体 ( Monoclonal Antibody,Mc Ab)的特性进行了研究。试验结果表明 ,其中 9株 Mc Abs为 Ig G类 ,4株为 Ig M类 ;这些 Mc Abs仅与抗传染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)发生特异结合 ,而与新城疫病毒 ( Newcastle DiseaseVirus,NDV)、传染性支气管炎病毒 ( Infectious Bronchitis Virus,IBV)和马立克氏病病毒 ( Marek'sDisease Virus,MDV)均不发生交叉反应 ,有 5株 Mc Abs具有中和 IBDV的活性 ,这 5株有中和活性的 Mc Abs识别的抗原位点在 IBDV的 VP2 上