枯草杆菌纳豆激酶基因的克隆与序列分析

用CTAB法从枯草杆菌（Natto)提取基因组DNA，聚合酶链式反应（PCR）扩增获得约1.3kp的DNA片段，在T4DNA连接酶作用下，将扩增片段连接到pUCm-T载体上，载化Ecoli DH5a感受态细菌。将初步鉴定的阳性细菌提取质粒DNA进行PCR鉴定和测序，序列分析结果证明获得了包含全部读码框的纳豆激酶基因。     

一株产纳豆激酶芽胞杆菌分离及鉴定

[目的]筛选并鉴定纳豆芽胞杆菌.[方法]筛选芽胞杆菌,显微镜观察其菌落形态,生理生化鉴定,测定其生长曲线及产纳豆激酶的酶活力.[结果]筛选到一株产纳豆激酶的纳豆芽胞杆菌ZD023.该菌最高酶活力可以达263.38 IU/ml.[结论]筛选到一株产纳豆激酶的纳豆芽胞杆菌ZD023,为下一步开发成具有溶栓功能的食品或药品奠定基础.     

纳豆激酶基因的克隆及表达研究

经PCR扩增获得了纳豆激酶基因(NK).将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/NK.转化宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下进行纳豆激酶的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,重组蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在.     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。     

纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选

分别从北京、大连和日本三个产地的纳豆食品中分离纯化得到了9个具有纳豆芽孢杆菌典型菌落特征的芽孢杆菌单菌落,与模式菌株纳豆芽孢杆菌N1株分别从菌落形态、个体形态和生理生化试验三方面进行对比鉴定,结果表明,其中5株芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌。将这5株纳豆芽孢杆菌分别在酪素平板上划线初选,得到了298株具有蛋白酶活力的菌株,从中筛选出活性最高的5株命名为:NB、NC、ND、NE和NF,测定各株发酵液的纳豆激酶酶活力,结果表明NB、NC和ND3株具有较高纳豆激酶活性,酶活力分别达到了1041.37、1125.13和1804.64IU·mL-1。     

纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

该文采用PCR方法扩增获得了纳豆激酶基因(pro-NK),通过酶切与酶连反应使其与原核表达载体Pet32a相连,构建重组质粒Pet32a-pro-NK,先转入到大肠杆菌DH5α中进行筛选与验证,再将阳性克隆子转化到宿主菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行纳豆激酶蛋白的表达研究。SDS-PAGE电泳分析结果表明,纳豆激酶蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达。     

苏云金芽胞杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及分析

利用pMD18-T克隆载体从苏云金芽胞杆菌菌株WB12中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA).测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000642)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.推测该蛋白质分子质量为28 ku,等电点为4.2,不含信号肽序列.利用DNAMAN软件构建同源关系树.结果表明,该蛋白与已报道具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的11个A iiA蛋白酶氨基酸序列总相似性为81.2%,并含有相同的氨基酸序列保守区.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%).     

苏云金芽孢杆菌8010蛋白酶基因保守区克隆及序列分析

通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段（可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因）.     

纳豆芽胞杆菌发酵对小米糠膳食纤维结构和理化特性的影响

[目的]本文旨在研究纳豆芽胞杆菌发酵对小米糠可溶性膳食纤维(soluble dietary fiber, SDF)和不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber, IDF)的结构和理化特性的影响。[方法]用纳豆芽胞杆菌液态发酵(37℃、180 r·min^-1,48 h)小米糠制备膳食纤维,分别通过Sevag法和酶法对得到的SDF和IDF进行脱蛋白处理,最后冻干。采用食品安全国家标准和高效液相色谱法测定样品的基本成分和单糖组成,使用扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪、X-射线衍射仪和激光粒度分析仪分析样品的结构,并测定样品的黏度、持水力、持油力、膨胀力、乳化活性、乳化稳定性、胆固醇和胆汁酸吸附能力、葡萄糖吸附能力和葡萄糖透析延迟指数。[结果]纳豆芽胞杆菌发酵使小米糠SDF的得率和纯度分别由5.17%和76.12%提高至19.36%和82.44%,IDF的纯度由73.45%提高至76.01%(P<0.05)。结构分析表明,纳豆芽胞杆菌发酵使膳食纤维(dietary fiber, DF)的表面结构变得疏松,粒径减小,比表面积增大,官能团和结晶度...     

甘蔗丝氨酸/苏氨酸激酶基因的克隆及序列分析

以福农28甘蔗品种为实验材料,电子克隆设计引物,克隆得到了甘蔗丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,STK)基因的cDNA片段。采用RACE技术克隆获得了甘蔗叶STK基因cDNA的5'及3'端序列,长度分别为750和1000bp。5'、3'端序列与中间片段重叠延伸后总片段长为1133 bp,其中5'UTR为54 bp,3'UTR为254 bp,包含完整的ORF为825 bp,共编码274个氨基酸。开放阅读框架查询器(Open Reading Frame Finder)确定其为丝氨酸/苏氨酸激酶,通过预测(//cn.expasy.org/tools)该蛋白质分子质量为29.9052 ku,理论等电点为6.36。将其基因序列与NCBI中其他植物的STK进行比对,与高粱、玉米、水稻、短柄草和大麦的相似性分别为97%、94%、89%、89%和88%。     

苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析

根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的 16个苏云金芽孢杆菌 (Bt)菌株进行检测.结果显示, 15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt8010肠毒素entS基因的编码框 (ORF)序列, 将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有 12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.     

纳豆芽孢菌剂消除小天鹅转群应激的研究

[目的]在小天鹅放养初期饲喂纳豆芽孢菌剂,研究纳豆芽孢菌剂消除小天鹅转群应激的临床效果。[方法]在转群小天鹅精饲料中加入纳豆芽孢菌剂,纳豆芽孢菌剂为精料量的10%,观察小天鹅的精神状态、体态行动、喙的颜色、羽毛色泽及成活率等。[结果]饲喂纳豆芽孢菌剂16 d后,小天鹅的体质、粪便、采食量等指标显著改善,圈养及外放后未见死亡。[结论]纳豆芽孢菌剂能起到改善小天鹅转群应激反应和降低死亡率的作用。     

纳豆生产优良菌株的筛选研究

[目的]筛选出最优的纳豆生产菌株。[方法]以实验室现有的16株纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)为出发菌株,通过蛋白酶、纳豆激酶及产黏(r-PGA)性能的综合指标,筛选出适合纳豆生产的纳豆芽孢杆菌。[结果]综合考虑,菌株DL-1521具有最高的蛋白酶、纳豆激酶和较高的产黏特性,具备作为纳豆生产优良菌种的特性。[结论]筛选结果可为纳豆直投式菌剂的制备提供优良菌株。     

全基因组预测枯草芽孢杆菌BEST195的分泌蛋白

枯草芽孢杆菌BEST195作为纳豆菌的一种,是纳豆生产的重要菌株之一。利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等预测程序对该菌中4456条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点等性质进行分析。结果表明：枯草芽孢杆菌含有分泌蛋白102个,其氨基酸长度、信号肽长度与植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A X A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了枯草芽孢杆菌BEST195分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守型特点。     

日粮添加纳豆芽孢杆菌对断奶后犊牛胃肠道纤维分解菌的影响

研究日粮中添加纳豆芽孢杆菌对断奶后犊牛瘤胃及肠道中主要的纤维分解菌琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flave faciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)和脂解厌氧孤杆菌(Anaerovibrio lipolytica)数量的影响.选取8头断奶犊牛,处理组犊牛日粮中添加含菌量为1010 CFU的纳豆枯草芽孢杆菌菌液.采集犊牛瘤胃食糜提取总DNA,利用种属特异性引物和实时荧光定量PCR计算菌群数量变化.结果表明,脂解厌氧弧杆菌是对照组犊牛消化道中的优势纤维分解菌;琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌存在于除十二指肠之外的其他肠道中.与对照相比,在处理组瘤胃、空肠和回肠中都检测到了黄色瘤胃球菌,犊牛其他肠道部位的纤维分解菌的数量均有增加,回肠中琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌及溶纤维丁酸弧菌的数量分别比对照组增加了69.3%、86.2%和76.5%.本研究表明纳豆芽孢杆菌促进了以上几种纤维分解功能菌群在断奶后犊牛消化道中的定植和生长.     

纳豆芽孢杆菌脲酶酶学性质的研究

为了研究不同的碳源、氮源和不同的培养条件对纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)脲酶产量的影响,以及不同温度、pH和几种金属离子对脲酶活性的影响,采用了滴定法(国标法,标准号GB/T 1356787-1997)和Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定不同碳源、氮源和不同培养条件培养的纳豆芽孢杆菌(CGMCC No.2801)脲酶总活性和浓度,以及不同温度、pH和金属离子条件下的脲酶活性。结果表明,当以谷氨酸为氮源、蔗糖为碳源、pH7、37℃条件下培养12h时脲酶的浓度最高,为57.2μg/mL。脲酶催化反应的最适条件为35℃、pH 7。实验选用的5种金属离子对脲酶活性均有抑制作用,抑制强度为Cu2+Zn2+Fe2+Mg2+Mn2+,最大抑制率为36.4%。这些结果为纳豆芽孢杆菌脲酶的进一步研究及低产氨纳豆芽孢杆菌的构建奠定了基础。     

纳豆菌生物学特性研究

研究了不同温度、pH值、培养时间、通气量、接种量、盐浓度因素对纳豆菌生长的影响,试验结果表明,该菌种生长适宜条件为：温度30-45℃;通风,转速140r／min,500mL三角瓶装液量100mL;pH值7．0;培养时间24h;接种量2％-5％。纳豆菌耐盐性较强,在含盐量8％的条件下仍能较好生长。