牛基因组DNA两种提取方法的比较研究

研究哺乳动物基因组DNA的水煮抽提法，并将传统的酚仿抽提法和水煮法进行比较，水煮法即通过对细胞的煮沸和冷却，使细胞破裂、蛋白变性，从而获得用于PCR扩增的模板DNA的方法。通过电泳分析和PCR扩增检测了所提取基因组DNA的完整性、可行性。检测时采用3对引物对2种方法提取的DNA进行了PCR扩增，同时对冷冻保存的基因组DNA也进行了扩增检测。结果表明：水煮法提取基因组DNA是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

两种动物组织DNA提取方法的比较

本试验以猪耳组织为试验样本,采用酚-氯仿抽提方法[1]和DNA提取试剂盒方法进行DNA提取的对比试验,并通过核酸蛋白定量仪测量了DNA浓度和纯度,并进行了PCR扩增实验。试验表明,两种提取方法都可以进行PCR扩增试验,但采用试剂盒提取方法提取DNA可以直接进行PCR扩增,而酚-氯仿提取法需放置一段时间后效果好,并且采用试剂盒提取的DNA纯度高、速度快、节省耗材、结果稳定、重复性强,适合大量DNA提取试验。     

东北林蛙基因组DNA不同提取方法的比较

为了研究不同方法提取东北林蛙基因组DNA的纯度差异,试验以东北林蛙为研究对象,采用高盐浓度抽提法、苯酚/氯仿抽提法、十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)、十二烷基磺酸钠法(SDS法)提取基因组DNA,进行PCR验证。结果表明:4种提取方法均能获得完整的基因组DNA,可以用于PCR扩增。高盐浓度抽提法提取的DNA纯度和制得率最高,成本低,安全系数高,操作简单,能够满足提取大量DNA的需求;其他3种方法需使用有毒、有害的有机试剂且时间较长。     

番鸭全血基因组DNA的提取与克隆

以柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝的番鸭全血为材料,采用酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA,并对基因组DNA进行PCR扩增、克隆并测序。结果表明,提取的基因组DNA纯度高,用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,主带清晰、无拖尾现象,无污染;通过PCR扩增有特异性条带出现,测序结果显示番鸭基因组DNA片段大小为868bp,与预期结果大小一致。     

家蚕胚胎期单卵基因组DNA的快速抽提

本文对用磁珠法抽提家蚕单粒蚕卯基因组DNA进行了探讨。结果表明从催青24h后到收蚁前一天的单卵中所提取的DNA断裂少、纯度高，能够满足特异性引物或随机引物进行PCR扩增的需要。每粒卯可获得100ng以上的DNA，能够进行多次重复检测，完全能够满足蚕种鉴定及纯度检测的需要。     

索氏抽提法测定油菜籽粗脂肪的实践体会

１前言测定粮食、油料脂肪含量的方法较多，如索氏抽提法、浸泡法、折射仪法、皂化法、比重法等。其中最普通、最常用的还是索氏抽提法。我们按照ＧＢ５５１２－８５粮食、油料粗脂肪测定方法中的索氏抽提法，对油菜籽的粗脂肪进行检测探讨。通过反复认真的操作实践，我们对该法有进一步认识和更深刻的体会试验的详细数据见表１和表２。２实践体会表１索氏抽提法检测油菜籽粗脂肪含量试验数据表品种名称样品重量ｇ样品水分％抽提瓶重ｇ抽提后烘９０ｍｉｎ冷却称重ｇ复烘冷却后各次称重ｇ粗脂肪重ｇ粗脂肪含量…     

蒙古马肠道细菌总DNA提取方法的比较

本试验采集蒙古马新鲜粪便样品,采用酚－氯仿抽提法和2种细菌基因组DNA提取试剂盒法进行样品中细菌基因组DNA的提取。通过DNA浓度和纯度的测定,并将其作为模板扩增细菌16S rDNA V3区特异性片段对提取效果进行比较,从而找出更适合蒙古马粪便中细菌基因组DNA的提取方法。结果显示,3种提取方法得到的基因组DNA均能用于PCR扩增的模板,其中B试剂盒法提取的DNA数量较多,且纯度高,更适合用于提取蒙古马肠道微生物细菌基因组DNA及后续的蒙古马肠道微生物多样性等分子生物学试验。     

瘤胃细菌DNA提取方法的研究与优化

为优化出可获得完整瘤胃细菌总DNA的方法,以满足分子生物学研究需要,试验采用3种DNA提取方法对瘤胃细菌DNA进行提取并对提取效果进行了比较。结果表明:细菌基因组试剂盒法提取的DNA其OD_(260)/OD_(280)值在1.8以上,电泳无杂带,DNA的提取效果最佳,PCR扩增效果较好;珠磨-CTAB法提取的DNA其OD_(260)/OD_(280)值在1.8以上,电泳结果存在少量杂带;水煮法提取的DNA其OD_(260)/OD_(280)值在2.0以上,无电泳条带,DNA严重降解。推荐采用细菌基因组DNA试剂盒法和珠磨-CTAB法对瘤胃细菌进行DNA提取。     

水牛全血基因组抽提方法优化

[目的]通过比较三种提取水牛全血基因组DNA的方法,获得一种安全、高效、快速的DNA提取方法,为水牛基因功能的研究奠定基础。[方法]收集43头水牛抗凝血样,每份血样随机分为等量3份,每份血样2mL,分别使用试剂盒改良法、试剂盒说明书法及酚仿抽提法提取全血基因组DNA。比较分析三种方法提取的同一头牛三份血样DNA的含量、OD260/280值、琼脂糖凝胶电泳和基因扩增结果。[结果]三种方法提取DNA的含量由高到低依次为试剂盒改良法、酚仿抽提法、试剂盒说明书法,各组间差异显著(1376.72±127.54VS 1121.32±81.64VS 326.18±21.17,P0.05)。三种方法提取DNA的OD-260/280值依次增加,试剂盒改良法与试剂盒说明书法OD260/280值差异不显著(1.85±0.0017 VS1.86±0.0021,P0.05),与酚仿抽提法OD260/280值有显著差异(1.85±0.0017VS 1.88±0.0029,1.86±0.0021VS 1.88±0.0029,P0.05)。三种方法提取DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示,试剂盒改良法和试剂盒说明书法DNA条带清晰、光密度高,酚仿抽提法条带模糊有拖带现象。三种方法所提取的基因组PCR扩增stat5基因获得较清晰准确的条带,扩增效果良好。[结论]试剂盒改良法用于水牛全血基因组的提取比试剂盒说明书法和酚氯仿法更安全、高效、便捷。     

山羊粪便总DNA提取方法的比较

本试验比较了从山羊粪便中提取总DNA的四种方法的优缺点,旨在为后续实验提供合适的提取方法。笔者首先采用PBS缓冲液过夜处理粪便标本,继而通过酚-氯仿抽提法、CTAB抽提法、天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法提取样品总DNA。结果显示：酚-氯仿抽提法提取的DNA完整性不好,且纯度低;CTAB法提取的DNA浓度和纯度都较高,但完整性不好;试剂盒法提取方便,操作简单,时间短,但提取的浓度较低,其中天根试剂盒法提取的DNA纯度高,完整性好。综合考虑,天根试剂盒法是提取山羊粪便总DNA的最佳方法。     

冬虫夏草菌丝水提液对SP2／0细胞凋亡的影响

在冬虫夏草菌丝水提液诱导下，采用Hoechst33342荧光染色、MTT、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等方法，观察和分析了SP2／0细胞的凋亡情况。结果显示，冬虫夏草菌丝水提液可抑制SP2／0细胞增殖，在荧光显微镜下，凋亡细胞呈亮绿色，DNA琼脂糖电泳可见典型的“阶梯状”条带，Annexin—V—FITC和碘化丙啶（PI）双染后流式细胞仪分析显示，细胞凋亡数量明显增多。表明，冬虫夏草菌丝水提液对SP2／0细胞增殖的抑制作用可能与诱导其凋亡有关。     

犬Ⅱ型腺病毒DNA的快速提取及限制性酶切分析

按常规方法培养大肾传代细胞(MDCK),待细胞长成单层后,以2%的量接种犬Ⅱ型腺病毒弱毒株(MV-CAV_2).当绝大多数细胞出现病变时(约35～40h),直接从感染细胞培养物中提取CAV_2 DNA.以该法提取CAV_2 DNA,不仅操作简便、耗费少,而且产量也比常规的先纯化病毒再提取DNA的方法高2～3倍.该法可普遍用于从感染细胞中提取与蛋白共价结合的所有病毒核酸.采用电泳洗脱法纯化上述CAV_2 DNA,以Eco RI、Bam HI、Pst I、Sac I、Nsi I和Sph I酶切,电泳分离,建立了该病毒DNA的6种限制性内切酶图谱.本实验结果为该病毒DNA的分子克隆奠定了基础.     

PCR方法特异性鉴定狮源性制品

目的建立可对狮DNA进行特异性检测的PCR方法,应用在检验检疫过程中获得的狮疑似样品和保护执法工作中难以检查辨认的狮产品进行物种鉴定。方法针对狮属动物线粒体细胞色素b(Cytb)基因设计特异性引物,用该引物分别对从亚洲狮、非洲狮和虎、豹、熊等14种非狮源性哺乳动物的肌肉、血液、毛发和肉骨粉中提取的DNA进行PCR(聚合酶链反应)扩增。结果试验表明所设计的引物对狮DNA具有特异性,从而达到了对该物种进行特异性检测鉴定的目的。检测灵敏度可达到在骨粉中检出0.5%含量的狮源性成分。结论该PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。     

鹅血液基因组DNA的简单快速提取方法研究

本研究针对家禽血液红细胞有细胞核的特点,研究适合鹅血液基因组DNA的廉价、简便、快速的DNA提取方法,并为其它禽(鸟)类相关操作提供参考。通过裂解细胞,利用简便快速的操作方法将蛋白质和核酸分离,去除杂质,沉淀核酸,获得大量基因组DNA,并通过基因扩增检测其质量和效果。该方法提取的基因组DNA电泳检测条带明量,无拖尾,含量及纯度均较高,能够用于分子生物学实验研究。与传统的酚-氯仿DNA抽提方法相比,本实验建立的血液基因组DNA提取方法具有成本低、操作步骤简便和快速的特点,特别是对大量样品的提取更为实用。     

新城疫病毒F48E9感染CEF细胞特异性表达基因的筛选鉴定

分别以NDV F48E9和La Sota株感染鸡胚成纤维细胞,于感染后8 h提取NDV感染CEF细胞总RNA,通过mRNA差异显示技术筛选病毒感染诱导表达的特异性基因.主要方法是先以锚定引物经反转录后,然后以9～10 bp随机引物为上游引物,以锚定引物Oligod(T)18为下游引物,进行PCR扩增,PCR产物采用8%的尿素变性PAGE胶电泳进行分离鉴定.对于特征性差异带进行第二次PCR扩增,克隆后测定其核苷酸序列.结果我们发现数个差异条带,选取差异带在500 bp以内的条带,经测序后显示经NDV F48E9感染后,有一条差异条带特异性表达的基因所编码的蛋白与Receptor(TNFRSF)-interacting serine-threonine kinase 2有47 %同源,是一个新基因,其蛋白功能不明确,有可能和细胞的凋亡有关.     

Improved pulsed-field gel electrophoresis procedure for the analysis of Flavobacterium columnare isolates previously affected by DNA degradation

Flavobacterium columnare is a fresh water bacterium that causes columnaris diseases in over 36 fish species. Intra-species typing of F. columnare can be performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). However, this method is hampered by the degradation of chromosomal DNA in about 10% of strains. In the current study, DNA degradation problems caused by extracellular DNases were overcome by fixation of cells with formaldehyde prior to isolation. The results substantiate that after problems due to DNases are overcome, PFGE analysis is a reproducible highly discriminating epidemiological method for studying F. columnare isolates regardless of fish host.     

单细胞凝胶电泳技术在临床兽医学中的应用

单细胞凝胶电泳技术是一种简便、快速、灵敏的检测真核细胞DNA损伤与修复的方法.其基本原理是将单个细胞包理于琼脂糖凝胶中进行裂解、电泳、荧光染色和显微镜观察,细胞DNA损伤产生的断链或碎片在电泳中迁移形成典型的"慧星"图像,根据迁移长度和荧光强度即可定量分析DNA损伤的程度.该文总结了该实验技术的基本原理、检测方法及其在临床兽医学中的应用前景.     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)染色体DNA的分离纯化

为了获取可供家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)单染色体测序的基础材料,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分离家蚕微孢子虫CQ1株系的染色体DNA,随后切取含有目的染色体DNA条带的琼脂糖胶块,分别利用电洗脱法、柱式胶回收试剂盒法及玻璃奶胶回收试剂盒法进行染色体DNA的分离纯化实验。结果显示3种方法均能回收到目的染色体DNA,但分离纯化的效率和样品质量存在差异:电洗脱法对胶块中的DNA损失较大,回收的染色体DNA含量低,而柱式胶回收试剂盒回收的染色体DNA断裂严重,因此这2种方法获得的样品质量均达不到染色体建库测序的要求;通过优化后的玻璃奶胶回收试剂盒法获得的染色体DNA相对完整且污染较少,质量检验分析133μL样品中的DNA质量浓度为8.495 ng/μL(DNA总量1.13μg),达到后续构建染色体测序文库的要求。玻璃奶胶回收试剂盒法不仅适用于家蚕微孢子虫染色体DNA的分离纯化,也可供基因组较小的物种制备单染色体建库测序材料参考。     

Canine Haematopoietic Chimerism Analyses by Semiquantitative Fluorescence Detection of Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism

Canine models are successfully applied to the study of haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Monitoring of haematopoietic donor/recipient chimerism is of major significance in detecting and quantifying engraftment or graft rejection of the donor-derived haematopoietic cells after transplantation. Radioactive analyses of polymorphic microsatellite markers are commonly used for chimerism analyses. We describe an improved, non-isotopic method that is based on the analysis of microsatellite markers in donor and recipient cells using capillary electrophoresis and fluorescence detection. Artificial mixtures of donor and recipient DNA that were generated from peripheral blood mononuclear cells from dog leukocyte antigen-identical siblings were used to analyse the sensitivity of the assay. DNA from dogs that had received HSCT were also analysed in order to demonstrate the feasibility of the method in vivo. For chimerism analyses, six different microsatellite loci were systematically amplified using fluorescent PCR primer. The fluorescent polymerase chain reaction products were separated by capillary electrophoresis using POP4 on a 310 ABI Prism Genetic Analyzer. After electrophoresis, fluorescence signals were automatically sized and quantified using GeneScan software. The method described provides an accurate assessment of haematopoietic chimerism in the canine model with significantly reduced hands-on time compared to conventional gel electrophoresis.     

牛4-细胞期胚胎mRNA的RT-PCR检测

凝胶银染法快速检测RT-PCR产物,有利于研究附植前胚胎的基因.选择体外培养的牛单个附植前胚胎,以锚定引物和随机引物RT-PCR扩增,用不同浓度聚丙烯酰胺凝胶在不同电压条件下电泳,2 g/L硝酸银染色,可以直接观察到大小不同的电泳条带,扩增的片段大多数在500 bp以下.研究表明,60g/L聚丙烯酰胺凝胶90 V电压电泳,电泳条带之间具有适当的距离,有利于差异条带分离和回收,是一种分离和检测DNA的有效方法.