企鹅扇贝与马氏珠母贝人工杂交育苗成功

企鹅珠母贝Pteria penguin生长速度较快，壳内面的珍珠层呈银白色，具有虹彩光泽，是适于培育大型珍珠的母贝。但由于该贝适应能力较弱，施术插核极易死亡。所以，至今还未获得人工培育的圆形珍珠。     

马氏珠母贝激光育苗的研究

马氏珠母贝是培育海水珍珠的主要贝类。近年来,由于近亲繁殖,种群退化,贝体越来越小,致使培育的人工珍珠颗粒也越来越细。为了改良品种,培育出数量多、质量好的马氏珠母贝苗,我们从1982年起,进行激光育苗研究,并于1987年结合生产试     

马氏珠母贝“南科1号”品系

马氏珠母贝,又称合浦珠母贝（Pinctada martensi Dunker,也有用Pinctada fucata Gould）,是生产海水珍珠的主要贝类。目前,我国培育“南珠”的主导品种为杂交贝或其后代,该贝虽然生长快、壳型大,但壳薄、软体部瘦小,插核后死亡率高、留核率低,不是适宜的植核母贝。     

马氏珠母贝人工育苗中的技术问题

近年来不少单位在马氏珠母贝育苗过程中因技术问题而使育苗效果差、经济效益低。为此笔者根据育苗实践谈几个技术问题。 1.亲贝和幼虫的优选 优选亲贝的标准是:3～4龄,活力强,外形完整,贝体厚大;生殖腺丰满,在足基处的两个乳头状突起较高,呈乳白色或橙红色,不透明,吸出的卵子放在载玻片上不易分散,卵子大小整齐,呈圆形或椭圆形,精子游动活泼。这样的亲贝育苗效果最好。幼虫的优选     

马氏珠母贝激光育苗机理的探讨

马氏珠母贝激光育苗，其产量比常规育苗增加１０倍以上，激光能增强精子的活力，提高精液品质，可影响卵子的通透性，使卵子新陈代谢中的某些反应发生良性变化。激光能抑制中致病菌及霉菌的生长，使受精卵发育成健壮的胚胎、幼虫、幼苗。所以，激光育苗是一种投产少，效益极高的育苗方法。     

马氏珠母贝EST微卫星的筛选

构建了马氏珠母贝的血液、足、鳃、胃、肝、心脏、外套膜、珍珠囊和感染多毛虫马氏珠母贝的血液(血感)等9个组织的cDNA文库,测序获得了6979个EST序列,从中查找到了268个重复序列,隶属于243个EST,含微卫星的EST数占EST总数的3.48%.珍珠囊cDNA文库含微卫星的序列所占比例最高,为6.16%,血感的最低,为1.65%.双碱基重复序列130个,占48.5%,(AT/AT)n类型最常见;三碱基类型的83个,占约31%,其中(AAT/ATT)n和(AAG/CTT)n较多;四碱基重复的有30个,占11.2%,(AAAT/ATTT)n占了该类型的约50%.一共能够设计151对微卫星引物,有130对可以扩增,占合成引物总数的86.09%,其中,多态性引物45对.多态性EST-SSR的筛选将为马氏珠母贝的分子遗传学研究、种质鉴定和野生资源保护等提供可靠的工具.     

马氏珠母贝精子的超低温保存

通过比较不同pH值（5．5-9．5）、不同盐度的海水等作为基础液对马氏珠母贝精子保存的影响,选择其中无激活精子作用又对其生理特性（活力,寿命,受精能力等）无影响者,加入二甲亚砜抗冻剂配制成超低温保存的抗冻保护液,精液与保护液按1：10和1：20的比例混合,样品按4组不同的降温程序平衡后转入液氮冷冻,比较其超低温冻存的效果。结果表明：以海水（pH7．5—8．0）为基础液,配制10％DMSO作为抗冻保护液,精液与保护液比例为1：20,在低温（0-4℃）中平衡约30min,在距液氮面15cm、5cm处分别停留5min、10min后转入液氮（-196℃）,冻存精子效果良好。冷冻24h、48h及5个月后,在38—40℃下水浴解冻复苏后,用终浓度0．25‰的氨海水刺激,精子存活率可超过60％,受精率可达80％。     

马氏珠母贝不同组织同工酶的比较

采用聚丙烯酰酰胺凝胶水平平板电泳技术,研究了马氏珠母贝的８种组织７种同工酶的酶谱表型,结果表明：所测组织中未检出α－磷酸甘油脱氢酶（α－ＧＰＤＨ）和醇脱氢酶（ＡＤＨ）,乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）只在肝脏一条微弱谱带,苹果酸脱氢酶（ＭＤＨ）、苹果酸酶（ＭＥ）和超氧化物岐化酶（ＳＯＤ）部分组织间有显著差异,而酯酶（ＥＳＴ）则具有明显的组织特异性。     

马氏珠母贝术前处理的研究

实验结果表明:经术前处理后的插核贝休养期存活率为95 2%,育珠期存活率达85 5%,每贝只插1个核,休养期留核率为0 86,育珠期留核率达0 71。珍珠的质量明显提高,优质珍珠的生成率高达34 6%,比对照组高出27 5%。     

马氏珠母贝人工育苗的若干关键技术

讨论了马氏珠母贝(Pinctada martensii)人工育苗的若干关键技术。马氏珠母贝育苗的关键是要做到亲贝优、幼虫优、饵料质量好数量足、水环境稳定。育苗的最高成活率可达31．1％,单位水体的出苗量可达62．3万个／m^3。     

马氏珠母贝蛋白的分离及分子量分布研究

试验结果表明,马氏珠母贝全脏器各分离蛋白组分占总蛋白含量分别为:非蛋白氮1.48%,肌浆蛋白33.20%,肌原纤维蛋白13.14%,碱溶性蛋白21.54%,基质蛋白30.65%;贝肌肉各分离蛋白组分占总蛋白含量分别为:非蛋白氮0.83%,肌浆蛋白26.56%,肌原纤维蛋白18.48%,碱溶性蛋白30.34%,基质蛋白23.79%;马氏珠母贝蛋白氨基酸组成均衡,呈味氨基酸及支链氨基酸含量高,但在各蛋白组分中的含量存在一定差异性.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的分子量分布结果显示,2种原料蛋白的肌浆蛋白分子量分布范围较宽,集中在200～19 kDa,肌原纤维蛋白分子量分布集中在200～45 kDa,碱溶性蛋白集中分布在41～3 kDa.     

企鹅珍珠贝同工酶酶谱特征及其遗传分析

采用垂直板状聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分离技术,对企鹅珍珠贝闭壳肌、外套膜、鳃、消化盲囊、足组织的SOD、EST、LDH、G6PDH、MDH、ME 6种同工酶酶谱特征及其遗传控制进行了研究。6种同工酶在不同组织中的表达有明显的差异,同工酶分析共检测到18个位点,其中有16个位点具多态性,群体中,多态位点比例为88.8％,平均杂合度为0.396±0.029。有13个多态位点上的基因型频率与Hardy-Weinberg定律相符(P>0.05),位点Ldh-1、Ldh-2、Sod-2极显著偏离该平衡(P<0.01)。在G6pdh-1位点发现较高频率的无效等位基因。     

马氏珠母贝Rab7基因的克隆及其表达特征分析

Rab家族基因在囊泡的形成、转运、黏附、锚定和融合等各个阶段发挥重要作用。在已有的马氏珠母贝RabcDNA片段的基础上,采用RACE方法克隆了该基因的全长。cDNA长度2519bp,编码区长618bp,编码206个氨基酸。编码的蛋白质序列分析表明,该基因具有Rab家族的全部保守结构,与人类等其他生物的Rab7亚家族的同源性最高。RT-PCR结果显示,该基因在马氏珠母贝的鳃、足和胃组织中没有扩增产物,在卵、感染和未感染凿贝才女虫Polydora ciliata的马氏珠母贝的肝脏和血液中均检测到了与预期大小相符的扩增产物,存在组织差异性表达。     

企鹅珍珠贝GLUT1 基因全长cDNA 克隆及其对葡萄糖的表达响应

葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是能量代谢的关键因子,为了探索GLUT1(glucose transporter type1)在企鹅珍珠贝(Pteria penguin)中的功能,开展了企鹅珍珠贝GLUT1基因的克隆与功能研究。利用RACE技术克隆出企鹅珍珠贝GLUT1基因,并命名为PpGLUT1。该基因cDNA全长为2 068 bp,编码522 个氨基酸,有2个跨膜螺旋区,N端和C端都在胞质侧,分子量为57.226 4 kD,理论等电点为5.17。不同组织荧光定量结果表明,在肠和外套膜中表达量最高,闭壳肌中的表达量显著低于其他组织。0.5 gmL- 1的高质量浓度葡萄糖注射实验表明,在注射后30 min内,肠PpGLUT1表达量升高,在30 min之后表达量逐渐降低,注射后第2小时表达量最低。不同浓度葡萄糖注射实验表明,当葡萄糖质量浓度为0.1～0.4 gmL-1时,PpGLUT1表达量逐渐上升;质量浓度为0.4 gmL-1 时,PpGLUT1表达量最高;大于0.4 gmL-1之后,表达量逐渐降低。上述结果表明,企鹅珍珠贝PpGLUT1主要在肠和外套膜表达, 并对葡萄糖注射有表达响应,可能在上述组织的葡萄糖转运过程中发挥作用。     

Fertilization,Hatching, Survival,and Growth of Third-Generation Colored Pearl Oyster (Pinctada martensii) Stocks

In April of 2009, third-generation black (BS₃), red (RS₃), yellow (YS₃), and white (WS₃) colored stocks of pearl oyster Pinctada martensii were compared in terms of fertilization, hatching, survival, and growth. Among stocks, there were no significant differences in fertilization rate (P > 0.05; values ranging from 94.8%–98.9%). Hatching rates of WS₃ were significantly lower (P < 0.05) at 61.3 ± 6.1% than other stocks (74.3 ± 5.4%, 75.9 ± 5.2%, 73.9 ± 4.9%, for BS₃, RS_3, and YS_3, respectively). Larval survival rates of the BS₃ stock (65.8 ± 9.4%), RS₃ (61.5 ± 8.7%), and YS₃ (58.2 ± 9.2 %) were significantly (P < 0.05) higher than that of the WS₃ stock (44.8 ± 11.2%). On day 8, there were no significant differences in mean shell length among the four colored stocks (P > 0.05). At days 15, 23, 90, 150, 210, and 325, however, significant differences in mean shell length among the four colored stocks were observed (P < 0.05). The BS₃ stock had consistently larger mean shell length than the other colored stocks.     

马氏珠母贝肉的营养成分及其游离氨基酸组成

对马氏珠母贝肉的营养成分及游离氨基酸组成进行了较系统的食品化学特性研究,结果表明：马氏珠母贝含粗蛋白７４．９％（干基）,蛋白质的氨基酸组成中,富含Ｇｌｕ（２．２１％）、Ａｓｐ（１．４５）、Ｇｌｙ（１．０１％）等呈味氨基酸;蛋白质营养价高,氨基酸价为８２,第一限制氨基酸是含硫氨基酸（１９７３年（ＦＡＯ／ＷＨＯ标准）;无机盐含量丰富,尤其是微量元素Ｚｎ和Ｓｅ;游离氨基酸中,牛磺酸含量最高达１．３８％,     

企鹅珍珠贝组织蛋白酶D的cDNA克隆、序列特征分析和应激表达研究

笔者初步研究了企鹅珍珠贝（Pteria penguin）组织蛋白酶D（cathepsin D,CTSD）的基因克隆和功能,通过同源克隆方法和cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得了企鹅珍珠贝组织蛋白酶D基因（命名为pgCTSD）。该基因cDNA全长1 767 bp,其中5＇UTR为38 bp,3＇UTR为553 bp,ORF为1 176 bp,编码392个氨基酸,包括信号肽（Met1-Ala18）、前体域（Leu19-Lys47）和成熟域（Tyr48-Ser392）三部分,分子量为42.3 kDa,等电点为8.04。pgCTSD氨基酸序列与大珠母贝（Pinctada maxima）pmCTSD的相似性最高（79%）,与其他物种的相似性为59%～75%。荧光定量分析表明,空白对照组中pgCTSD mRNA在闭壳肌、性腺、肝胰脏、外套膜和鳃组织中都有表达,且在闭壳肌中表达量最少,肝胰脏中最高。与试验对照组相比,脂多糖（LPS）刺激6 h后性腺和肝胰脏显著下降,闭壳肌的表达量虽不大但增加显著,外套膜和鳃组织变化不显著;哈维弧菌（Vibrio harveyi）刺激6 h后肝胰腺和外套膜显著下降,闭壳肌和鳃显著上升,性腺无显著变化。肝胰腺中pgCTSD对LPS和弧菌刺激的应答反应表明pgCTSD可能参与了免疫反应。     

马氏珠母贝TNFR27基因克隆与功能初探

肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)是一类重要的细胞因子受体,主要参与细胞凋亡、宿主免疫防御、炎症等生物过程。本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了马氏珠母贝TNFR27(PmTNFR27)的cDNA全长并进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝不同组织、脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(Poly(I:C))及镉胁迫后的表达模式。结果显示：PmTNFR27 cDNA全长为1 524 bp,5′UTR长为186 bp,3′UTR长为248 bp,包含28 bp的poly(A)尾巴,开放阅读框(ORF)为1 062 bp,编码353个氨基酸;结构域预测表明PmTNFR27具有一个典型的CRD结构域和一个跨膜蛋白结构域,符合肿瘤坏死因子受体超家族特征;多序列比对结果表明贝类种间的相似性不高,但功能结构域位置较保守。系统进化树结果显示马氏珠母贝与其他贝类聚为一簇。qPCR结果显示,PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝各组织中均有表达,在鳃中表达量最高。LPS刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的表达量于3 h达到最高,于72 h降到最低;Poly(I:C)刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的表达量在6 h、12 h显著上升并达到最高至96 h时降到最低。镉胁迫后,3 h表达量达到最高,24 h、48 h表达量显著下降。研究结果显示PmTNFR27可能参与了马氏珠母贝的免疫应答反应。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii) FBP基因的克隆及其对温度胁迫的响应

果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是催化糖异生过程中的限速酶,当动植物处于温度胁迫等不良环境条件时,FBP通过参与糖异生途径以维持机体的糖平衡,在动植物抗逆过程中起着重要作用。本研究通过RACE技术获得了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii) FBP(Pm-FBP)基因cDNA全长,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝不同组织中的表达量,以及在17℃(低温组)、22℃(对照组)、32℃(高温组)条件下鳃中的时序表达模式。序列分析显示,Pm-FBP全长为1381 bp,具有54 bp的5¢ UTR和62 bp的3¢ UTR,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,预测分子量为37.13 kDa,等电点为6.02。Pm-FBP具有一个Pfam FBPase保守结构域,6个潜在的O-连接糖基化位点(Ser36、Ser56、Ser57、Ser76、Ser80和Thr115),1个潜在的N-糖基化位点,1个金属结合位点(Asp-Pro-Ile/Leu-Asp-Gly/Ser-Thr/Ser)和46个磷酸化位点。多序列比对结果显示,Pm-FBP与长牡蛎(Crassostrea gigas)FBP的相似性最高,为83%;系统进化树显示,Pm-FBP与长牡蛎等贝类聚为一支,然后再与其他软体动物聚为一大支,节肢动物和脊椎动物分别聚类,进化树总体聚为三大支。实时荧光定量结果显示,Pm-FBP在所检测的闭壳肌、鳃、性腺、肝胰腺、足和外套膜等组织中均有表达,在性腺表达量最高,肝胰腺和鳃中有较高表达;对Pm-FBP时序表达的分析发现,Pm-FBP在低温组和高温组实验时间范围内均出现先上升后下降的趋势,且在72 h时达到最大值,表明Pm-FBP参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;在120 h时,高温组和低温组的Pm-FBP表达量均显著下降,表明Pm-FBP可能主要在短期的温度胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探索马氏珠母贝对温度胁迫的适应性提供了参考资料。     

马氏珠母贝不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代主要性状的比较

为了培育马氏珠母贝新品种，开展了不同地理种群内自繁和种群间杂交的工作，获得了3个自繁群体和3个杂交群体，BB1、DD1和SS1分别来自北海野生种群(BW)、大亚湾野生种群(DW)和三亚野生种群(SW)自繁一代；BDl、BS1和DSl分别来自BW与DW、BW与SW以及DW与SW杂交一代。运用方差分析对6个子一代群体的5个主要性状(壳长、壳宽、壳厚、总体重和壳重)进行了比较，3个杂交群体未表现出杂种优势。但获得的6个群体将成为进一步选育的基本群体。子一代的变异性增加为进一步选育奠定了基础。