对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26的毕赤酵母组成型分泌表达

近年来,重组 VP28和 VP26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据GenBank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到VP28和VP26基因,再用引物悬挂法将EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到 VP28和 VP26基因的5￠端和3￠端。目的基因经双酶切后插入到表达载体pGAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化 X-33毕赤酵母感受态细胞,经 Zeocin 抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到VP28和VP26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载pGAPZαA组相比,VP28和VP26表达上清液组有明显的条带,证明VP28和VP26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP19及VP28的研究进展

自二十世纪90年代,白斑综合征病毒(WSSV)就因其暴发范围广、致死率高得到了广泛的关注。研究主要集中在确定该病毒蛋白的结构及功能,以及利用其囊膜蛋白制备亚单位疫苗、研发DNA疫苗等来提高对虾抵抗白斑综合征病毒的能力,尽管免疫防治目前在实验室阶段已取得了显著的保护效果,但因其给药方式局限以及成本较高等因素一直没有应用于实际生产中。VP19和VP28是白斑综合征病毒主要的囊膜蛋白,在WSSV感染对虾的过程中起着非常重要的作用。本文从WSSV的基因组学、VP19和VP28的蛋白质结构及其在免疫防治中的应用等方面概述了VP19和VP28的研究进展,包括蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗以及相关抗体的研究。在总结了不同类型疫苗的保护效果后发现,VP19和VP28的双价疫苗的保护率较高,为今后制定有效的WSSV控制方法提供了参考。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因在毕赤酵母中的表达

白斑综合征病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害东南亚及北美洲沿岸养殖对虾的重要病原。近十年来,国内外对该病毒的形态结构、基因组全序列、宿主范围、传播途径、致病性和组织细胞特异性等作了大量的研究[1-7],并已确定该病毒的侵染与其囊膜蛋白vp28有关[8]。实验根据已发表的白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28基因序列[9]设计一对引物,通过PCR扩增出该囊膜蛋白的基因片段。将该片段连接到毕赤酵母表达载体pPICZ上,在大肠杆菌中筛选到含目的基因的重组质粒pPICZVP28,用电穿孔法将重组质粒转化到毕赤酵母菌株X33中,获得了转化子X33 …     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是在水产养殖中引起对虾等甲壳类动物发生严重病害的病原体。VP28是WSSV中最重要的囊膜蛋白之一,在WSSV感染对虾的初期起着至关重要的作用。文章从基因和蛋白质结构、VP28在病毒入侵中的作用及免疫应用等方面概述了VP28的研究进展,可为WSSV的防治研究提供参考。     

重组WSSV囊膜蛋白VP281和VP31的抗菌功能初步分析

为了解白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)两种囊膜蛋白VP281和VP31的功能,本实验对二者进行了原核重组表达.利用一种组成型分泌原核表达质粒pBTA1为表达载体,构建了组成型分泌WSSV囊膜蛋白rVP281、rVP28以及rVP28与增强型绿色荧光蛋白rEGFP融合蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α,分别命名为DhpVP281、DhpVP28和DhpVP28-EGFP.3种重组菌在LB固体培养基上生长12 h的菌落直径分别为(164.84±28.44)、(560.47±46.04)和(548.21±58.54)μm,生长19 h的菌落直径分别为(436.31±47.56)、(1 136.90±110.88)和(1 083.33±109.83) μm,生长24 h的菌落直径分别为(594.19±57.17)、(1251.19±188.86)和(1 264.29±172.78) μm;显示在所有培养时间,DhpVP281的菌落均显著小于DhpVP28或DhpVP28-EGFP的菌落(P＜0.05),推测rVP281的表达可能抑制大肠杆菌的生长.以pBTA1为表达载体,未能成功构建组成型分泌rVP31的重组DH5α.为了解其原因,使用pET-30a(+)为表达载体,构建了表达rVP31包涵体的重组菌株BL21(DE3) pLysS.将rVP31蛋白纯化并复性后,采用牛津杯法,检测到rVP31蛋白对溶壁微球菌具有抗菌作用.在动物病毒中发现具有抗菌作用的囊膜蛋白,可以增加有关WSSV的病毒学方面的知识.     

抗WSSV囊膜蛋白（VP28和VP19）单抗的体内中和效果研究

通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同稀释度对虾白斑综合征病毒（WSSV）与已制备的WSSV囊膜蛋白单克隆抗体结合的OD值。利用克氏原螯虾Cambarus proclarkii动物模型,将不同稀释度病毒与单抗1：1混合孵育2h后,肌肉注射克氏原螯虾（50μl／只）,观察记录螯虾的死亡情况。ELISA结果显示,在1×10^-3病毒稀释度下两种单抗均足量。在螯虾体内中和实验中,当病毒浓度为1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6稀释度时,MAb1D6（VP28）螯虾组最终死亡率分别为100％、90％、16．7％和6．7％,而MAb2E9（VP19）螯虾组最终死亡率分别为100％、100％、100％和93．3％。这表明随病毒浓度的降低,MAb1D6（VP28）的中和效果越明显。而MAb2E9（VP19）并无明显的中和效果。     

对虾白斑综合征病毒VP28酵母表面展示

以pYD1为载体,制备以酒精酵母为载体的基因工程免疫制剂。参照GenBank中对虾白斑综合征病毒VP28基因序列设计引物,PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切插入用于酒精酵母表面展示的穿梭质粒载体pYD1,转化大肠杆菌TOP10,提取阳性质粒转化酒精酵母菌株EBY100,诱导表达后,用免疫荧光检测外源蛋白的表达。结果获得VP28酵母表面展示菌,测得最佳诱导时间为36～48h。以此展示酵母活细胞分设两个浓度组,腹腔注射螯虾,检测其毒性。结果表明,此重组酵母对螯虾是安全的,该研究为下一步对虾用活载体免疫制剂效果的研究奠定了基础。     

对虾白斑综合征病毒vp28基因的表达及其与血细胞的结合

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pBAD/gIIIA-VP28并转化大肠杆菌E.coli.用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,显示有与预期大小31kDa相符合的目的蛋白.荧光显微镜方法分析显示,表达的VP28可与克氏原螯虾血细胞结合.结果表明,在合适的培养条件下,构建的重组表达载体pBAD/gIIIA-VP28不仅能够表达vp28 基因,而且表达的VP28具有很高的抗原结合活性.     

1个白斑综合症病毒基因的克隆及其在大肠杆菌M15中的表达

根据对虾白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）1个可能编码蛋白的开放读码框（open reading frame，ORF）的序列（WSSV A基因），结合pQE30载体的多克隆位点，设计1对引物进行PCR，扩增出大小为0.28kb的A基因片段。把目的片段克隆到pGEM-T Easy载体上，构建出重组质粒pGT-A，再用引物两端酶酶切出目的片段，并按正确的读码框顺序插入到pQE30表达载体上的乳糖操纵子中，构建出带有目的片段的重组质粒pQE30-A，然后将重组质粒转化到大肠杆菌M15细胞，经IPTG诱导，SDS-PAGE和Western blot显示有与A基因预期大小11kD相吻合的融合蛋白带。结果表明，来源于WSSV的这一ORF是1个可表达的基因。     

罗氏沼虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的克隆及分析

根据已公布的罗氏沼虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因序列设计一对特异性引物,从疑似患白斑病毒病的罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增、克隆并测序后将该片段通过GenBank比对,证实为WSSV的VP28基因;与20个已公布的WSSV VP28进行同源性比较,结果显示:从中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、日本对虾、波纹龙虾提取的病毒株聚为一类,印度对虾WSSV VP28为另一类,罗氏沼虾WSSV VP28又单独为一类。根据测序结果推测VP28蛋白的二级结构在氨基酸的7～29区间可能为跨膜螺旋区,且该区域高度保守。     

Increased resistance to white spot syndrome virus in Procambarus clarkii by injection of envelope protein VP28 expressed using recombinant baculovirus

In order to investigate whether protein structure has an effect on protective effect of envelope protein of WSSV, VP28 protein was expressed both in Escherichia coli (pET-VP28) and insect (BmN) cells (BmNPV-VP28). The baculovirus (BmNPV) expression system was used to obtain correctly folded VP28 protein. Procambarus clarkii crayfish were intramuscularly injected with lysates of cells infected with recombinant pET-VP28 and BmNPV-VP28, respectively, and then challenged by intramuscular injection of WSSV to assess the duration of protection. The crayfish injected with BmNPV-VP28 showed generally lower mortality rates when compared to crayfish injected with pET-VP28, resulting in relative percent survivals of 92% and 39%, respectively, when compared to the control groups injected with empty vectors BmNPV and pET-30a. These results showed that VP28 protein produced in BmN cells gave much better protection than VP28 protein produced in E. coli.     

Prokaryotic expression of a hub protein of white spot syndrome virus with vaccine potential

Envelope proteins of white spot syndrome virus (WSSV) play an important role in viral entry as well as in triggering host defences. To date, some main envelope proteins such as VP28, VP24 and VP19 have been expressed heterologously and proved effective in WSSV prevention. However, VP62, an envelope protein with hub function as well as better antigenicity, has not been focused on. In an attempt to prepare this protein for rapid purification and further functional analysis, N‐terminus‐truncated VP62 was expressed in Escherichia coli using two common fusion tags, including hexahistidine (his6) and solubility‐enhancing tag thioredoxin (Trx). The results showed that the truncated VP62 fused with C‐terminal His‐tag could not be expressed in either E. coli BL21(Plyss) or Arctic Express, but it could be expressed in the form of inclusion bodies in Arctic Express with N‐terminal tag. After refolding and His‐tag affinity purification, the protein with purity over 90% was obtained. This study laid the foundation for evaluation of its vaccine potential as well as further application in WSSV prevention.     

Protection of crayfish, Cambarus clarkii, from white spot syndrome virus by polyclonal antibodies against a viral envelope fusion protein

White spot syndrome virus (WSSV) is a large double-stranded DNA virus, causing considerable mortality in penaeid shrimp and other crustaceans. WSSV produces five major structural proteins, including two major envelope proteins, VP28 and VP19. To produce VP28 and VP19 as a single protein for antibody production, DNA sequences encoding both open reading frames were fused together and cloned into pET-22b(+) expression vector. The fusion protein, VP(19+28), was expressed in Escherichia coli, purified using Ni2+ His affinity chromatography and injected into a rabbit. Antiserum collected from the immunized rabbit was tested in vivo for ability to protect crayfish, Cambarus clarkii, from disease caused by WSSV. Fifteen days after challenge with WSSV, treatment with VP(19+28) antiserum gave 100% protection against disease in the ambient temperature range of 15-22 degrees C and 65% protection at a constant temperature of 26 degrees C. These results demonstrated VP(19+28) antiserum is effective in protection of crayfish from WSSV and confirmed that VP19 and VP28 play an important role in WSSV host infection. Targeting both VP19 and VP28 may be effective for the design of both immunotherapeutic medicines and reagents to detect WSSV.     

白斑综合征病毒(WSSV)3种PCR检测方法的灵敏度比较

为了探讨不同PCR检测方法的灵敏度,分别利用TaqMan实时定量PCR、世界动物卫生组织(OIE)公布的巢式PCR引物(简称OIE)、黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室(GB)设计的引物(简称GB)及2种巢式PCR对应的一步法PCR,对具有不同白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)含量的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)样品进行检测.结果显示,当使用已知病毒含量的标准品进行检测时,TaqMan实时定量PCR方法可以检测到l0个WSSV拷贝;OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法分别可检测到104和103个WSSV拷贝;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增时,分别可检测到5×104和2.5×104个WSSV拷贝;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物进行一步法PCR扩增时,分别可检测到104和5×103个WSSV拷贝.使用上述PCR方法分别对44份未知WSSV含量的样品进行验证,定量PCR方法检测阳性率为84.09%,OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法检测的阳性率分别为18.18%和27.27%;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率均为15.91%;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率分别为18.18%和20.45%.根据以上结果,PCR方法检测WSSV的灵敏度由高到低依次为:定量PCR、巢式PCR、一步法PCR.     

对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性

应用克氏原螯虾作为动物模型研究对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）的感染增殖特性，涉及感染温度，感染途径，继发感染，半数致死量（ＬＤ５０），免疫保护及保存期等，结果显示，２２－２５℃时，接种ＷＳＳＶ的螯虾一般于２－７d内死亡，温度升高对病毒增殖影响不显著，３０－３２℃时，平均死亡时间２－６d，温度降低对病毒增殖影响较显著，１５－１９℃时，接种螯虾平均２－１０d内死亡，８－１０℃时，平均死亡时间３－６d，感染途径分别用腹节肌肉，腹节皮下洲射及口服，均能使螯虾感染发病，而浸泡方式不能使螯虾发病，细菌分离和细菌定量结果表明，寄考于螯虾心脏，肝胰腺内的阴沟肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是正常螯虾的２５和３０倍，形成继发感染，用螯虾心脏，肝胰腺内的阴肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是政党螯虾的２５和３０倍，形成继发梁。用螯虾测定ＷＳＳＶ的ＬＤ５０为１０^-6.5.mL^-1种毒液，将病毒５６℃，３０min灭活后免疫螯虾，不能使螯虾形成免疫保护，ＷＳＳＶ匀浆液－３０℃冻存１年后失活，而－３０℃冻存于螯虾体内ＷＳＳＶ保存１年后仍有活力。