猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板，测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析，并对抗原表位进行预测，结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物，分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因，分别用pET-28a表达载体进行重组后，获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达，b段表达较高，可溶性表达较好，纯化后，可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性，并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强，可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

猪瘟病毒石站株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，利用２对此物，从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因，片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定，自动测序和序列分析，结果显示该基因较保守，与其他猪瘟病毒毒株均有很同的同源性，与同 ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

[目的]预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位。[方法]综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数,预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的抗原表位。[结果]推测B细胞表位位于非洲猪瘟病毒VP73蛋白N端的11~18、26~48、73~82、136~150、159~174、181~1891、91~2102、47~276、279~295、313~323和382~392区段内或上述区段附近。[结论]应用多参数预测非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位,为今后进一步研究非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特征以及表位疫苗的研制奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白的B细胞表位预测

非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF）是由ASF病毒（AS-FV）引起的猪急性、烈性传染病。ASFV可以编码34种以上的结构蛋白。VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋白,能够诱导机体产生中和抗体,而且抗原性极为稳定,可作为ASFV的主要诊断试剂。笔者利用生物信息学方法,分析了来自Spain 70株的ASFV VP73蛋白的二级结构,并对该蛋白的B细胞表位进行预测,     

猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,利用２对引物,从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因,片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

丙型肝炎病毒NS4B蛋白调控Hep3B细胞非折叠蛋白质反应研究

研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。     

抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

[目的]制备抗猪瘟病毒（CSFV）的单克隆抗体（MAb）。[方法]以纯化的猪瘟病毒免疫4～6周龄BALB／c雌鼠,取其脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞进行融合,筛选出抗CSFV单克隆抗体杂交瘤细胞株。[结果]经间接ELISA获得3株能稳定分泌抗CSFVE2蛋白的MAb杂交瘤细胞,分别命名为1AS、5F3和4D2。Mab亚型鉴定表明3株MAb均为IgG2b,轻链均为K链。Westernblot结果表明3株Mab均能识别重组E2蛋白。间接免疫荧光试验表明3株Mab均与CSFV呈阳性反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）呈阴性反应。[结论]该研究为建立CSFV特异性检测方法奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3／4A的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成，具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶（NTpase）和螺旋酶（Helicase）的功能，在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥着重要作用．非结构蛋白NS4A，其主要功能就是作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，在HCV多氨酸成熟过程中发挥着不可替代的调节作用．此外，NS3／4A还参与NS5A的超磷酸化修饰过程．     

胰岛激活蛋白促进小鼠生长的作用

在两次实验中给体重27～39g的成年雌性或雄性小鼠腹腔注射细菌源性胰岛激活蛋白(IAP)0.4或2μg/鼠.结果表明,注射IAP可使小鼠4周平均体增重比对照组提高44;～82;,胴体重量也有增加的趋势.胴体脂肪组织含量和比例明显增加(p＜0.05),而胴体肌肉组织比例不受影响.注射IAP不影响动物的采食量,但增加脂肪存留,提示IAP可提高营养物质的利用率.     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

细小病毒非结构蛋白NS1功能的研究进展

介绍了细小病毒非结构蛋白NS1的生化特性,综述了近年来NS1蛋白与病毒复制、宿主细胞凋亡之间以及与基因表达调控之间的关系,并对NS1蛋白的进一步研究提出了建议。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

A型流感病毒非结构蛋白NS1的研究进展

对NS1蛋白的进化、结构、调节病毒的致病性等进行了综述,在此基础上,对抗流感病毒药物及其防控技术进行了展望,以期为流感病毒的预防和治疗提供更多的可能性。     

松桉混交林与纯林的林木生长效应研究

[目的]研究松桉混交林与纯林的林木生长效应.[方法]通过近10年来松桉混交林的技术跟踪和数据分析,与其相应的纯林进行对比.[结果]研究显示混交林生长效应优势显著,可最大限度地利用土地资源,解决收益周期矛盾,利于生物多样性发展.[结论]该研究为松桉混交林营林模式的推广提供了一定的理论支持.