一株禽腺病毒4型病毒分离与鉴定

为了对某肉鸡场暴发的疾病进行确诊,对送检的病死鸡进行解剖、细菌分离和荧光PCR检测,并进一步进行鸡胚半数致死量(ELD₅₀)、动物回归试验和组织灭活疫苗研制。结果显示：病死鸡剖检可见肝脏肿大、出血,心包胶冻样积液,肾脏肿大,病料未分离到细菌。PCR检测禽腺病毒4型(FAV4)阳性,用处理液进行病毒分离,成功分离到一株FAV4病毒,扩增所分离病毒hexon基因部分序列,测序结果与GenBank上的FAV4 hexon基因(登录号：EF554403)相似性为100%。分离病毒盲传3代,测定的ELD₅₀为104.5/0.2 mL,以0.2 mL·只^-1的剂量胸部肌肉注射30日龄SPF鸡5只,4 d内鸡只全部死亡,病变与临床剖检病死鸡相似。取病死鸡肝脏制备组织灭活疫苗,免疫SPF鸡,能抵抗所分离FAV4病毒攻击。研究成功分离鉴定出一株FAV4病毒,并进行初步研究,丰富了毒种库,为FAV4病毒疫苗研制奠定了基础。     

狐源犬瘟热病毒泰安株(CDV-FOX-TA)的分离与鉴定

从具有疑似犬瘟热症状的病狐血液中分离到1株病毒,该病毒在MDCK细胞上生长良好,并能形成稳定的CPE。经电镜观察、理化特性、滴度测定、动物回归试验、RT-PCR和荧光定量RT-PCR鉴定,证实分离到的病毒为1株犬瘟热病毒强毒株,命名为CDV-FOX-TA。     

禽腺病毒4型的分离与初步鉴定

从疑似心包积液综合征的病死鸡组织中分离获得1株病毒,该病毒无血凝活性,提取其核酸经禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病毒、禽偏肺病毒和包涵体肝炎病毒特异引物扩增均为阴性,而经禽腺病毒4型特异性引物检测为阳性,则将其暂命名为禽腺病毒4型FJ1674株。将其扩增产物回收后克隆,经序列测定分析表明该株病毒与国内外禽腺病毒4型毒株的同源率为99.4%~100%;经遗传进化分析表明,其与禽腺病毒4型关系密切,共处同一分支。     

犬蝠源呼肠病毒的分离与鉴定

 【目的】从野生蝙蝠体内分离病毒，为开展蝙蝠的病原监测奠定基础。【方法】从广东省韶关采集了30份野生犬蝠样品，研磨后接种Vero E6细胞，从中分离到2株病毒，对其中一株病毒进行研究，使用生物学与分子生物学方法确定其分类学地位。【结果】该毒株在Vero E6细胞上盲传至第4代开始出现细胞病变，表现为细胞内颗粒增多，细胞收缩、变圆，最后细胞从瓶壁脱落。反复冻融3次后，收集细胞及培养液，电镜观察发现，病毒粒子无囊膜，有双层衣壳，呈正二十面体对称，将病毒命名为Bat/China/2003（B/03）。红细胞凝集试验表明该病毒能凝集健康人O型血红细胞，不能凝集SPF鸡、实验用普通级牛、大鼠和豚鼠的红细胞。理化特性试验表明该病毒对氯仿有抵抗力、能耐受pH3.0的酸性环境、50℃水浴1 h病毒丧失感染能力、1 mol•L-1 MgCl2能提高病毒对热的抵抗力。病毒基因组经琼脂糖凝胶电泳分大、中、小3个区段。用哺乳动物呼肠病毒特异性引物进行反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR），扩增得到了预期大小的片段。测序结果经NCBI BLAST分析表明，与呼肠病毒科正呼肠病毒属的Ndelle virus核苷酸同源性最高为91.2%。用DNAMAN Multiple Alignment进行序列同源性分析，与哺乳动物呼肠病毒血清1、2、3型的代表株T1L，T2J，T3D的核苷酸同源性分别为89.9%、76.9%、89.9%。【结论】由以上结果推断该病毒为呼肠病毒科的成员。     

鹅Ⅲ群腺病毒的分离与鉴定

采集无临床症状鹅的泄殖腔分泌物或病鹅的肠道、肝脏、脾脏，按常规方法制成接种液接种鸭胚，以血凝和血凝抑制的方法检测病毒。结果表明：从50多个样品中分离到2株腺病毒，分别命名为H5J24和N8J8。这2株病毒均能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，其凝集作用可被抗Y81G4株鹅腺病毒多抗血清所抑制，但不能被抗新城疫病毒单抗、抗H5和H9亚型禽流感病毒单抗所抑制。经形态学观察、理化特性测定和PCR检测，证明这2株病毒为Ⅲ群禽腺病毒成员。     

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

[目的]了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础.[方法]采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPT)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析.[结果]从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽Ⅰ型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60 h,ICPI为1.45;分离株F基因112~117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%.[结论]猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽Ⅰ型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势.     

3株犬源乳酸杆菌的分离鉴定与益生特性研究

从散养的健康成年中华田园犬粪便中分离乳酸杆菌,研究其益生特性,旨在开发犬用益生菌菌株。采用MRS改良培养基从田园犬粪便中分离出3株乳酸杆菌,进行细菌染色形态观察、生理生化试验和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定为唾液乳酸杆菌(L.salivarius)、约氏乳酸乳杆菌(L.johnsonii)和瑞士乳酸杆菌(L.helveticus),分别命名为TCSL1、TCSL2和TCSL3。随后进行体外耐酸试验、抗胆盐试验、细胞黏附试验、抑菌试验和小鼠口服促生长等益生特性试验。结果显示,3株分离菌株能耐受0.6%的胆盐、pH值2.0的酸度;对犬肠黏膜上皮细胞黏附率均在65%以上;其上清液对犬致病性大肠杆菌均有抑制作用;连续28 d饲喂小鼠,未见腹泻和死亡现象,TCSL1和TCSL2能显著增加小鼠体质量(P0.05)。从散养田园犬粪便中分离到的3株乳酸杆菌具有益生特性,可作为犬用益生菌制剂的候选菌株进行开发。     

犬细小病毒的分离与鉴定

从临床表现体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等疑似细小病毒 (Canine Parvovirus,CPV)感染的病犬中 ,采取粪样 8份。应用狗肾传代细胞 (MDCK)增毒 ,其中 6号病料 (CPV6 )在 MDCK细胞上产生脱落、变形、游离等细胞病变 ,且细胞感染性试验发现 ,CPV6对 MDCK的感染性强于对猫肾传代细胞 (CRFK )的感染性 ;核酸型试验证明 ,CPV6毒株的代谢可被 5 -溴脱氧尿核苷 (FUDR)所抑制 ,其核酸属于 DNA型 ;所分离的病毒培养物能凝集猪、猴、马、猫的红细胞 ,凝集效价达 2 6 ～ 2 8,并能被已知犬细小病毒阳性血清所抑制 ,但不能凝集牛、犬、绵羊、兔、小鼠和鸡的红细胞 ;电镜观察病毒粒子外观呈圆形或六边形 ,直径约 2 0～ 2 3nm ;该病毒耐酸、耐热、耐乙醚 ;动物致病性试验表明 ,经口服 1m L ,试验组幼犬第 7天发病 ,采集病犬粪样做 HA试验为阳性反应 ,其凝集猪红细胞的特性能被犬细小病毒阳性血清所抑制。     

犬细小病毒的分离与鉴定

采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定,并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV,分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变,血凝效价达1∶27～1∶210,细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制,接种幼犬后,分离株3可以引起试验犬发病死亡。     

犬冠状病毒的分离及鉴定

为有效防治犬冠状病毒病,促进养犬业的健康发展。从疑似犬冠状病毒(CCV)症状病犬粪便中分离出1株病毒,从形态学、理化学、生物学等方面对该病毒进行了鉴定。细胞培养证实该病毒有致细胞病变效应。物理化学鉴定表明该分离病毒核酸类型为RNA,有囊膜,对氯仿和乙醚敏感,对1%胰蛋白酶不敏感,耐酸性较强,具有一定的耐热性,最高耐受限是50℃,无血凝性和红细胞吸附特性,符合犬冠状病毒的特点。中和试验进一步证明该分离病毒是一种犬冠状病毒;牧羊犬接种1 d后就出现了临床症状,所有攻毒犬扑杀后都有肠以及肠系膜淋巴结病变。该分离病毒是一种RNA病毒,可以引起试验犬出现典型犬冠状病毒病症状,是犬冠状病毒。     

犬瘟热病毒的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定犬瘟热病毒(CDV)的石河子流行株。[方法]对临床症状疑似犬瘟热和血清学(ELISA)检测为阳性的自然发病犬,取其淋巴结为病料,接种于非洲绿猴肾细胞系(Vero),进行病毒的分离;用RT-PCR检测感染CDV分离株特异性核酸。[结果]病料接种Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),用RT-PCR技术可扩增出CDV特异性核酸,扩增出的基因片段与预期设计的长度相同,所扩增的CDV分离株H基因片段与CDV C54标准强毒株核苷酸同源性为98.4%。[结论]该研究成功分离并鉴定了CDV石河子流行株,为犬瘟热(CD)的确诊提供了依据。     

鸭病毒性肝炎病原分离鉴定与防治研究

从三门峡某鸭场疑似鸭病毒性肝炎的发病或病死肉雏鸭的肝脏中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、雏鸭保护试验、鸭胚中和试验鉴定为血清 型鸭病毒性肝炎病毒。从而证明引起雏鸭大量发病和死亡的主要原因为鸭病毒性肝炎所致。用鸭病毒性肝炎标准毒株多次强化免疫家兔 ,获得兔抗鸭病毒性肝炎高免血清 ,用此高免血清给发病雏鸭紧急注射 ,获得了满意的治疗效果     

犬瘟热病毒贵州株CDV-GZ1的分离与鉴定

为丰富我国犬瘟热病(CD)的流行病学资料,同时为CDV贵州分离株主要抗原基因及结构研究奠定基础,对贵阳市某宠物医院犬瘟热病毒金标卡检测呈阳性病死犬的肝脏、肺脏、淋巴结等组织,取适量经混合研磨过滤后,同步接种于Vero传代细胞上进行病毒分离培养,并对该分离毒株进行理化特性、电镜形态、血清学和核酸检测等系列鉴定。结果表明:在Vero细胞上盲传至第6代时稳定出现特征性的CPE,该毒株为RNA囊膜病毒,电镜下可见胞浆包涵体、病毒粒子呈晶格状排列,病毒可被犬瘟热阳性血清中和,分离病毒为犬瘟热病毒并被命名为CDV-GZ1株。     

番茄内生真菌的分离和拮抗生防菌的筛选

采用内生菌常规分离法对健康番茄植株体内的内生真菌进行了分离和筛选。结果表明: 番茄的不同品种不同部位内生真菌的数量有所不同, 同一品种茎部比根部种类多。经初步鉴定, 除1种属于子囊菌外, 其余均为半知菌。拮抗结果表明: 无孢菌、曲霉对灰霉和菌核病菌均有较强的抑制作用, 产生明显抑菌带。其它部分菌株对病原菌均有不同程度的抑制作用。无孢菌Fq72菌株培养滤液活性测定结果表明: 其培养滤液对6种病菌均有不同程度的拮抗作用, 尤其对菌核病菌和灰霉病菌抑制率最高, 而且其培养滤液高温处理后活性不丧失, 对病菌仍有较强的拮抗作用, 因此其具有一定的生防潜能。     

一株絮凝剂产生菌TS-1的分离与鉴定

[目的]筛选鉴定出高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌。[方法]通过培养基培养分离纯化出高絮凝活性的菌株并通过培养特征观察和生理生化特征测定鉴定筛选出的菌株。[结果]通过用稀释涂布平板法和平板划线法从土壤中分离、纯化和初筛后,从供试土样中共分离到14株具有絮凝性能的细菌,经复筛后得到5株絮凝活性较高（絮凝率〉70%）的絮凝剂产生菌,其中1株经多次传代培养后絮凝活性仍很稳定（絮凝率始终〉90%）,其标记为TS-1。TS-1菌为具有荚膜的革兰氏阳性杆菌,并且菌体内无类脂物质如聚β-羟基丁酸。TS-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,故将该菌定名为Bacillus TS-1。[结论]该试验筛选出的菌株可用于淀粉工业废水的絮凝处理和生化处理。     

犬冠状病毒的分离鉴定及其S基因的克隆

从疑似犬冠状病毒(CCV)症状病犬粪便中分离出一株病毒,合成通用引物(2Bp,4Bm)和CCV特异性引物(CCVF2,CCVR2)进行RT-PCR反应及限制性内切酶BstXⅠ酶切鉴定,并将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中。RT-PCR反应结果,BstXⅠ酶切鉴定结果以及重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段。重组质粒测序结果与GenBank的CCV序列进行比对,与之相符,表明本次实验分离到的病毒为CCV。     

一株絮凝剂产生菌TS-1的分离与鉴定

[目的]筛选鉴定出高絮凝活性的微生物絮凝剂产生菌。[方法]通过培养基培养分离纯化出高絮凝活性的菌株并通过培养特征观察和生理生化特征测定鉴定筛选出的菌株。[结果]通过用稀释涂布平板法和平板划线法从土壤中分离、纯化和初筛后,从供试土样中共分离到14株具有絮凝性能的细菌,经复筛后得到5株絮凝活性较高（絮凝率〉70%）的絮凝剂产生菌,其中1株经多次传代培养后絮凝活性仍很稳定（絮凝率始终〉90%）,其标记为TS-1。TS-1菌为具有荚膜的革兰氏阳性杆菌,并且菌体内无类脂物质如聚β-羟基丁酸。TS-1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,故将该菌定名为Bacillus TS-1。[结论]该试验筛选出的菌株可用于淀粉工业废水的絮凝处理和生化处理。     

甘肃省辣椒炭疽病菌的分离鉴定及生物学特性

对甘肃省天水市辣椒炭疽病菌进行分离、鉴定和生物学特性研究。结果表明,经致病性测定分离物LC8可以引起典型症状,为致病菌;LC8菌落呈圆形,初期乳白色绒毛状,后中央变为墨绿色,菌丝无色,有隔,有分枝,分生孢子长圆柱形,单孢,无色,内含油滴,大小(12.624～18.645)×(3.928～4.995)μm,分生孢子盘垫状,其上生无色、具分隔的分生孢子梗;经ITS、CHSI、ACT、TUB2和GAPDH基因序列分析表明,分离物LC8与斯高威尔炭疽菌(Colletotrichum scovillei)同源性为100%,在系统发育树上聚为一支,将其鉴定为斯高威尔炭疽菌(C.scovillei)。该菌菌丝最适生长温度25℃、pH 6.0和全黑暗,碳源为甘露醇,氮源为蛋白胨;最适产孢温度35℃、pH 8.0和12 h光暗交替,碳源为果糖,氮源为蛋白胨;最适孢子萌发温度30～35℃、pH 6.0和全黑暗,碳源为6-脱氧-L-甘露糖,氮源为蛋白胨。该研究结果为甘肃省天水市辣椒炭疽病的诊断及科学防治提供理论基础。     

核桃仁霉烂病病原菌鉴定及生物学特性研究

对核桃仁霉烂病病原菌进行了分离鉴定,并对其生物学特性进行了研究。结果表明,核桃仁霉烂病病原为立枯丝核菌。病原菌最适生长条件为:25~30℃,pH值5~9,PDA培养基,连续光照。核桃应储存在低温、干燥条件下,以抑制病原菌生长,减少病害的发生。