鳜不同亚型瘦素受体基因克隆与表达分析

以鳜(Siniperca chuatsi)为研究对象,使用cDNA 3′末端快速克隆法扩增瘦素受体基因(lepr)cDNA序列,获得了由mRNA 3′端可变剪切产生的鳜lepr的4个不同亚型,包括编码序列(coding sequence, CDS)长度为3 474 bp、编码1 157个氨基酸的长型受体亚型lepr-L,以及3个短型受体亚型lepr-S1、lepr-S2和lepr-S3,CDS长度分别为1 512、945和915 bp,分别编码503、314、304个氨基酸。对氨基酸序列进行结构域分析和多重比对发现,鳜lepr长型受体亚型包含完整的功能域,短型受体亚型无跨膜区及胞内结构,鳜lepr及其leptin结合域(leptin binding domain, LBD)序列保守程度高。鳜lepr在鳃中表达最高,其次是肾和垂体,腹腔注射鳜leptin B而非leptin A的同源重组蛋白2 h后引起脑lepr表达量的升高(P<0.05)。以上结果表明,鳜leptins能引起组织中lepr表达的不同变化而发挥独特的生理功能。     

鳜胰岛素样生长因子-Ⅱ cDNA基因的克隆与表达特征

为全面获得鳜Siniperca chuatsi GH-IGFs生长发育轴的调控因子特征,采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了肝组织胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)cDNA序列。结果表明:鳜IGF-ⅡcDNA全长为1 643 bp,包括5'端非翻译区103 bp、3'端非翻译区892 bp和开放阅读框648 bp,开放阅读框编码215个氨基酸;鳜IGF-Ⅱ前肽由信号肽、成熟肽和E肽3部分组成,其中信号肽为47个氨基酸,成熟肽为70个氨基酸,E肽为98个氨基酸;鳜IGF-Ⅱ氨基酸序列与其他脊椎动物的相似度为81%～98%,与鳜IGF-Ⅰ的相似度为62.5%。运用实时荧光定量PCR技术检测了鳜成鱼不同组织以及孵化后0～22 d仔稚鱼中IGF-ⅡmRNA的表达情况,结果表明:IGF-ⅡmRNA在鳜脑中表达量最高,在肌肉、心脏、胃、鳃、肾脏中表达量次之,在脾、前肠、后肠、性腺、肝脏中表达量较低;在孵化后早期发育阶段均检测到有IGF-ⅡmRNA表达,孵化当天(0 d)表达量最高,之后表达量有所降低。本研究结果可为鳜IGF-Ⅱ对生长发育的调控作用研究提供科学依据。     

翘嘴鳜快肌和慢肌糖代谢相关基因的表达分析

采用荧光定量PCR技术,检测翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)快肌和慢肌中与糖代谢相关的16个基因的表达情况,并比较其表达差异性,分析翘嘴鳜肌肉糖代谢调控特点。结果显示:在快肌和慢肌中,与葡萄糖摄取和磷酸化相关的基因存在显著性差异表达的各有4个;与糖原代谢相关的基因有显著性差异表达的有2个;PI3K、MAPK5、MAPK63个基因在快肌中的相对表达量极显著高于在慢肌中的,表明与这3个基因相关的葡萄糖的摄取和利用快肌强于慢肌;而MEF2α、PGC–1α、PGC–1β、PDK1、MAPK4、GYS1、GSK3β7个基因在慢肌中的相对表达量显著高于快肌,表明与这7个基因相关的葡萄糖的摄取和利用慢肌强于快肌。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

NF-κB家族亚基在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平表达差异的分析

羊毛是养羊业的主要产品之一,其是由皮肤内的附属器官毛囊发育而来,其中弯曲度是衡量其质量的重要指标之一。为了解NF-κB家族各亚基(NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL)在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平的表达差异,分析其在不同品种绵羊背部皮肤中与形成毛发性状差异相关的关键性基因,选取美利奴羊和晋中绵羊2个不同品种的绵羊作为研究对象,利用实时荧光定量PCR方法检测不同品种绵羊背部皮肤中NF-κB各亚基的表达水平。结果显示,NF-κB各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中的相对表达量均有差异,除RELA外,其余各亚基mRNA的相对表达量美利奴羊均高于晋中绵羊;美利奴羊皮肤中,NFκB2 mRNA相对表达量最高,RELA mRNA次之;晋中绵羊皮肤中,RELA mRNA相对表达量最高,NFκB2 mRNA次之。结果揭示,NFκB2可能对于羊毛弯曲性状的形成具有促进作用,而RELA可能对于羊毛弯曲性状的形成具有抑制作用;NFκB2与RELA适当的相对表达水平可能对于毛发弯曲性状的形成起重要的调控作用。     

褪黑激素对PDGFA基因在绒山羊皮肤毛囊中表达模式的影响

【目的】探讨血小板衍生生长因子A（platelet-derived growth factor A,PDGFA）在内蒙古阿尔巴斯绒山羊皮肤毛囊上的表达规律和褪黑激素对其的影响。【方法】选择体重和产绒量相当的阿尔巴斯绒山羊成年母羊,分为4组,即从不埋植的对照组和3组不同时间埋植褪黑激素的试验组。试验组在埋植期间每隔一个月按照2 mg?kg-1 BW的剂量在绒山羊耳后皮下埋植褪黑激素。采集12个月（从2009年8月至2010年7月）的受试羊体侧部皮肤样品,用定量逆转录PCR （qRT-PCR）检测皮肤中PDGFA基因的表达量。【结果】各组间PDGFA基因的表达模式不同。对照组在11月时其表达量为全年最低,在12月,随着毛囊周期性生长缓慢进入退行期,其PDGFA基因的表达量也缓慢上升,并在休止期（1-4月）高度表达。而开始埋植褪黑激素后,仅第二年埋植组在翌年1月时表达量显著提高（P<0.05）;在2月与连续两年埋植组一样,随着绒毛开始脱落,PDGFA基因的表达量也有下降趋势;到5月,其表达量显著低于1月（P<0.05）,此时新一轮的绒毛已长出体表。停止埋植褪黑激素后,仅第一年埋植组翌年PDGFA基因的表达模式和毛囊生长周期与对照组基本一致。【结论】绒山羊皮肤组织当中PDGFA基因在毛囊生长期低表达,退行期和休止期高表达。埋植褪黑激素可缩短毛囊生长周期。PDGFA基因是一个控制毛囊从兴盛期向退行期和休止期转化的因子。     

胰岛素样生长因子I基因在鹅不同发育时期皮肤及毛囊组织中的表达

以吉林白鹅和籽鹅为试验对象,采用RT-PCR及免疫组织化学技术,检测28,56日龄鹅皮肤组织中IGF-I基因表达和定位情况.结果表明:IGF-I mRNA表达于上述两个日龄的皮肤组织中.IGF-I特异性免疫染色明显表达于28日龄吉林白鹅和籽鹅胸部皮肤毛根鞘的扁平细胞和复层细胞.腹部皮肤内根鞘、外根鞘及毛小皮.在56日龄...     

内皮素受体在不同毛色绵羊皮肤中的表达和定位分析

 【目的】研究内皮素受体A和B(endothelin receptor A and B, EDNR A and B)在绵羊皮肤中的表达与定位,以及在不同毛色中的差异比较,探讨其在绵羊毛色形成中的作用及其相关机制。【方法】以不同毛色的成年绵羊为研究对象(设黑色毛和白色毛两组),用RT-PCR法检测EDNR基因在不同毛色皮肤中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析不同毛色绵羊皮肤EDNR基因的相对表达量,采用免疫组织化学法和Western blot法对EDNR在绵羊皮肤中的表达进行定位和定量分析。【结果】荧光定量PCR结果显示黑色绵羊中EDNRA的相对表达量是白色绵羊的1.2648倍,EDNRB的则是1.8248倍;Western blot结果显示,皮肤组织粗蛋白提取物中含有EDNR蛋白,且受体A在黑白两组皮肤中表达不显著(P＞0.05),受体B在黑色组的表达显著高于白毛组(P＜0.05);免疫组化实验结果显示,EDNR蛋白在两组皮肤的表皮和毛囊中均有表达,通过光密度分析,受体A在黑毛皮肤各处细胞中的表达显著高于白毛皮肤,受体B则在除毛根鞘之外的其它两处细胞中表达显著高于白毛皮肤(P＜0.05)。【结论】实验结果提示,EDNR参与绵羊皮肤黑素细胞的生成,且两受体作用效应存在差异。     

鹅皮肤毛囊中WNT6基因mRNA的表达分析

为了探究可能影响毛囊发育的WNT6基因在鹅皮肤毛囊各个生长发育时期是否表达以及毛囊发育状况,试验选择18,35,48,68,88,108日龄6个不同生长时期的卡洛斯鹅和籽鹅,采集背部皮肤,通过组织消化法获得皮肤毛囊并提取总RNA,采用荧光定量PCR的方法计算WNT6基因在皮肤毛囊中的相对表达量,并通过HE染色法观察不同时期毛囊的发育状况及毛囊的不同形态结构。结果表明：WNT6基因在鹅皮肤毛囊的各个生长发育阶段均有表达且表达量有较大差别。在卡洛斯鹅中,WNT6基因在18日龄中相对表达量最高,88日龄相对表达量最低。在籽鹅中,WNT6基因在108日龄中相对表达量最高,88日龄中相对表达量最低。表明WNT6基因在参与鹅的皮肤毛囊生长发育过程中起到一定的促进作用。     

不同体色翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)群体遗传结构研究

采用微卫星分子标记技术分析黄色(HS)、黑斑色(HB)、红纹色(HW) 3个不同体色翘嘴鳜群体的遗传多样性及遗传结构。3个不同体色群体平均观测杂合度在0.540～0.687之间;平均期望杂合度在0.562～0.631之间,各群体均具有较高的遗传多样性。遗传距离、相似度、遗传分化系数、聚类树分析均显示HB与HW群体间遗传关系较近。STRUCTURE群体结构分析显示,3群体被分为2个亚群,HS群体集中在亚群I,HB、HW群体集中在亚群II。30个位点中的大多数位点偏离Hardy-Weinberg平衡,应增加选育群体的有效数量,防止种质衰退。符号检验和Wilcoxon符号秩次检验中HW群体显著或极显著偏离突变-漂移平衡,需进一步扩大选育群体。总体来说,3个不同体色翘嘴鳜群体遗传多样性较高,可作为开发新体色翘嘴鳜品系的基础群体。     

长江中游湖泊鳜与大眼鳜的渐渗杂交

在长江中游鄱阳湖和洞庭湖鳜采样中,采集了兼具鳜(Siniperca chuatsi)和大眼鳜(S.kneri)部分形态特征的中间类型(主要特征:口裂后缘伸达眼睛后缘之下,眼睛大小、头后背前部隆起介于鳜与大眼鳜之间)48尾。为了明确中间类型的分类学关系,采用量化传统形态分类指标、筛选种间特异微卫星标记,对中间类型个体进行鉴定分析。结果:(1)量化分析表明,鳜和大眼鳜在头长/眼径、(吻长+眼径)/口裂长上存在显著差异,鳜头长/眼径为5.286～7.157、(吻长+眼径)/口裂长为0.811～0.999,大眼鳜分别为3.306～5.106和1.040～1.166。48尾中间类型中,5尾判定为鳜,其他43尾个体仍不能鉴定。(2)从28对微卫星标记中筛选出5个鳜和大眼鳜的种间鉴别位点(T103、T063、T089、T135、W19517),利用这5个位点对中间类型的个体进行遗传分析和鉴定,中间类型中有16尾为种间杂交后代,其中9尾为杂交F_1与大眼鳜的回交个体。长江中游湖泊中鳜和大眼鳜存在种间渐渗杂交,今后需加强长江鳜鱼野生资源遗传监测和管理。     

鳜骨骼肌快肌和慢肌的组成特征比较

骨骼肌组成特征是鱼类肉质性状评价的重要基础。为全面了解鳜（Siniperca chuatsi）肉质性状的组成特征,通过制作骨骼肌石蜡切片,比较了鳜快肌和慢肌两种类型骨骼肌的组织学特征,快肌和慢肌在肌纤维细胞直径、形态上存在差异。利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了鳜快肌和慢肌的蛋白质组成特征,它们在50～60 ku和10～15 ku大小的条带中存在差异。克隆了鳜快肌和慢肌肌球蛋白重链（MHC）S1结构域的序列,快肌和慢肌S1结构域cDNA序列长度分别为2 523 bp、2 520 bp,编码841、840个氨基酸,氨基酸序列的相似度为87.6%,以两个loop区的差异最大。研究结果表明,鳜快肌、慢肌在肌纤维细胞形态、蛋白质组成以及肌球蛋白重链分子结构上均存在较明显的差异,这些差异与其担负不同的运动功能相关。     

鳜雌雄表型差异及性别相关标记筛选

为了解鳜(Siniperca chuatsi)雌雄性别表型差异,测量120日龄养殖鳜的体重及主要形态性状,雄性平均体质量(396.52±74.81)g,雌性平均体质量(442.17±54.02)g,雌性比雄性增长快10.32%;雄性头长/头高比显著大于雌性;雌性体长/体高比极显著大于雄性。通过组织学观察孵化后5～60日龄鳜性腺发育分化过程,25日龄前,性腺未分化,30日龄精巢分化,40日龄卵巢分化,精巢分化早于卵巢。利用AFLP技术筛选鳜雌雄性别相关分子标记,在4个引物组合E5M8、E1M8、E6M7、E7M3中筛选出5个雌雄差异位点,其中,E5M8-480在雄性中扩增比例为91.67%,E1M8-440和E5M8-370在雌性中比例分别为91.67%和83.33%,E6M7-280和E7M3-380为雌性特有条带。研究结果为鳜雌雄性别异形与性别鉴定提供了基础和依据。     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

赤眼鳟和麦瑞加拉鲮的化学组成、能量密度及对鳜的营养价值

为评价赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)和麦瑞加拉鲮(Cirrhinus mrigala)对鳜(Siniperca chuatsi)的营养价值,分别测定了体质量为(5.27±1.03)g的赤眼鳟、(5.05±1.21)g的麦瑞加拉鲮和(5.19±0.92)g的鳜的化学组成,估算了这3种鱼的能量密度,以探讨赤眼鳟代替麦瑞加拉鲮养殖鳜的可行性。结果显示,赤眼鳟和麦瑞加拉鲮的全鱼蛋白质含量显著高于鳜,水分显著低于鳜(P0.05),必需氨基酸指数分别高达92.56%±2.31%和93.17%±0.36%,多数必需氨基酸的化学评分≥0.82。而赤眼鳟的脂肪和能量密度更高,显著高于麦瑞加拉鲮和鳜,灰分显著低于麦瑞加拉鲮(P0.05)。研究表明,这两种鱼对鳜都具有较高的营养价值,但赤眼鳟的营养价值更高,以赤眼鳟代替麦瑞加拉鲮养殖鳜是可行的,这为转变鳜的养殖方式提供了参考。     

中国乌骨鸡品种BCDO2基因多态性和肤色鉴定

为分析β-胡萝卜素脱氧酶2(β-carotene dioxygenase2, BCDO2)基因在我国乌骨鸡中的变异情况，采用PCR方法分别扩增和测序了我国5个乌骨鸡品种(丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡和新兴竹丝鸡3号)、白耳黄鸡(黄肤色)和崇仁麻鸡(白肤色)的BCDO2基因，并与GenBank数据库中的原鸡序列进行系统发育分析。结果显示：7个品种215条序列，总计发现6个多态位点，分别为6273091(G-A)、6273129(A-G)、6273229(C-T)、6273240(C-T)、6273307(A-G)和6273672(A-G)。基于6个多态点界定了3种单倍型，定义为Hap1、Hap2和Hap3。其中只有白耳黄鸡、崇仁麻鸡和丝羽乌骨鸡有1种单倍型，东乡绿壳蛋鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡和新兴竹丝鸡3号均有2种单倍型。系统发育分析显示：Hap1和Hap2只与红色原鸡聚为一类，Hap3和多个原鸡聚为一类。BCDO2基因多态位点能够很好地区分黄白肤色的品种，但很难区分乌骨鸡品种。多个原鸡在我国乌骨鸡品种形成过程中都做出了贡献。该研究结果为我国乌骨鸡遗传资源的保护、选育和鉴定工作提供了遗传背景信息。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

葡萄风信子MaMYB1基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有与BHLH蛋白结合的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。MaMYB1与玉米ZmP1及拟南芥MYB12的关系较近。酵母单杂交检测表明:MaMYB1具有转录激活活性。实时定量PCR分析结果表明:MaMYB1在不同组织中均有表达,以在花中表达量较高,且在花不同发育时期表达量差异显著。【结论】从葡萄风信子中克隆到1个新的MYB基因MaMYB1;推测该基因可能参与了葡萄风信子花发育过程的调控。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。