用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。     

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库的构建

构建外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与靶蛋白相互作用蛋白的前提条件。为给大麦抗逆基因的研究及抗逆转基因大麦材料的创制奠定基础,利用5μmol·L-1ABA和蒸馏水分别处理大麦种子0h、6h、12h、24h,剥取大麦的胚,用热酚法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR并进行均一化处理获得ds-cDNA。经SfiⅠ酶切的ds-cDNA与pGADT7-Rec载体连接后,转化大肠杆菌感受态细胞DH10B构建文库。结果表明,文库的容量为1.1×106,插入片段大于1 000bp,集中在1 000~3 000bp之间,符合酵母双杂交文库的要求。     

核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁RS-1 的SSH文库构建

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,用核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary)对6叶期幼苗进行接种。提取经核盘菌诱导前和诱导后的宁RS-1叶片mRNA,经反转录成cDNA,以及经过酶解后加接头和两次杂交,构建差异表达的抑制消减(SSH)cDNA文库。正向消减文库是以诱导后的宁RS-1 cDNA为tester,以正常的宁RS-1 cDNA为driver。所构建的正向文库重组率达到96.2%,反向文库重组率达到94.5%,文库容量均达到了2 190和2 780,表明所构建的文库质量良好。对从文库中随机挑取的克隆进行测序分析,获得了与抗病和代谢有关的基因,如γ-谷氨酰半胱氨酸酶基因、抗真菌蛋白基因、铁蛋白基因、ACC氧化酶基因等,为开展油菜抗菌核病重要功能基因的克隆和鉴定奠定了基础。     

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.     

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cDNA文库的构建和鉴定

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cDNA与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cDNA文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。     

花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定

以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。     

抗白粉病基因PmCH1357相关分子标记验证与评价

由禾本科布氏白粉菌Blumeria graminis(DC.) f. sp.tritici(Bgt)引起的白粉病是影响小麦产量和品质的一种主要病害。为了评价小麦抗白粉病基因相关分子标记在育种中的有效性与实用性,本试验利用感白粉病品种晋麦66和小偃麦衍生品系CH1357构建的341个F_(2:3)家系为材料,利用本课题组前期已定位的8个与抗白粉病基因 PmCH1357相关的分子标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25、Xmp510、Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190)对群体进行PCR检测,并接种白粉菌株E09进行苗期抗病性鉴定,分析PCR扩增产物与白粉病抗性间的相关性。结果表明,4个标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21和Xbwm25)对群体检测的纯合抗病基因型与纯合抗病表现型符合率均达到93%以上,可用于抗白粉病基因 PmCH1357的筛选;为进一步提高标记筛选的准确性,可使用多个标记组合,使用基因同一侧的标记组合进行选择会降低选择效率,使用基因两侧标记组合进行选择可有效提高选择的准确性。使用标记组合Xcfd81+Xbwm8对抗白粉病基因 PmCH1357进行选择可以获得更高的准确性及更多有效植株。     

新疆小麦白粉病菌群体遗传多样性分析

为了解新疆小麦白粉病菌群体多样性及其间关系,利用ISSR分子标记对2020年喀什、阿克苏、和田、昌吉、塔城共5个地区13个县市小麦白粉病菌群体进行遗传多样性研究。结果表明,喀什、阿克苏、和田、昌吉、塔城小麦白粉病菌群体的遗传距离为0.031 7~0.094 5,塔城与阿克苏群体的遗传距离最近,和田与喀什的遗传距离最远;总体Neis遗传多样性指数为0.257 1,群体Neis内遗传多样性指数为0.217 5,群体内的遗传变异占总体变异的84.60%,表明遗传变异主要来源于群体内。群体间基因流N_m值为2.749 0,表明新疆不同区域群体存在一定的基因交流。Normalized Mantel Statistic分析表明,小麦白粉病菌群体间遗传距离与地理距离相关性不大。     

白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非寄主抗性基因 NHO1(non-host resistance 1)编码的甘油激酶(glycerol kinase,GK),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程。为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用RT-PCR方法克隆获得了转录自抗病种质N9134的三个部分同源染色体的小麦 NHO1基因(分别命名为 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B和 TaNHO1-2D),分析三个 TaNHO1同源基因的序列、启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位。序列分析结果表明,小麦 TaNHO1-2A/2B/2D基因CDS区序列全长分别为1 605、1 599和1 605 bp,分别编码534、532和534个氨基酸残基;3个同源基因均含有与 AtNHO1(AT1G80460.1)基因以及 OsNHO1(Os04G0647800)基因高度相似的FGGY_N端和FGGY_C端结构域。经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着 TaNHO1可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程。qRT-PCR结果表明,在N9134抗病近等基因系响应白粉菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B基因在侵染早期均上调表达,而 TaNHO1-2D则表现出多次波动的表达模式;在N9134感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后48 h均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染。经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质、细胞膜以及核膜。     

168份小麦不同病害抗性材料白粉病抗性鉴定及其Lr34/Yr18/Pm38位点的分子检测

为了发掘更多的小麦白粉病抗性种质资源,对收集到的168份小麦不同病害抗性材料进行了白粉病苗期和成株期抗性鉴定,并利用STS标记csLV34以及功能标记cssfr3、cssfr4、cssfr5和Yr18E11a对其Lr34/Yr18/Pm38位点的等位变异类型进行检测。结果表明,在168份小麦种质中,共鉴定出41份白粉病苗期抗性品种(系)以及96份慢白粉病品种(系)。功能标记cssfr3和cssfr4可准确鉴定Lr34/Yr18/Pm38位点第11外显子中的等位变异,而功能标记cssfr5和Yr18E11a在检测时存在小频率的错判。在96份慢白粉病材料中,有24份材料携带Lr34/Yr18/Pm38的等位变异类型,这些材料在2个年份下的白粉病田间MDS均低于不携带Lr34/Yr18/Pm38的等位变异类型的材料。     

野生二粒小麦NBS-LRR类抗病基因家族的鉴定及其表达分析

野生二粒小麦(Triticum dicoccoides L,2n=4x=28,AABB)是普通小麦遗传改良的重要种质和基因库。抗病基因(resistance gene,R基因)是植物体内广泛存在的抗性基因,通常具有NBS(nucleotide-binding site)和LRR(leucine-rich-repeat)结构域,属于NBS-LRR家族,在植物抗病和免疫过程中具有重要作用。为挖掘和利用野生二粒小麦基因组中的R基因,基于最新发布的野生二粒小麦参考基因组数据,利用生物信息分析手段,在全基因组水平上对其NBS-LRR类R基因家族进行鉴定。结果共鉴定到429个可信度较高的NBS-LRR类R基因,其中N亚家族66个,CNL亚家族205个,NL亚家族76个,CN亚家族79个,PN亚家族3个;进一步对NL亚家族R基因进行分析,发现76个NL亚家族基因在所有染色体上均有分布,并且以成簇方式存在,包含20个保守域,且在N端高度保守;表达模式分析发现,它们在花、叶片和根中的表达量较高;最后,随机选择4个NL类R基因,发现在白粉菌诱导后均上调表达。本研究为进一步挖掘和利用野生二粒小麦NBS-LRR类抗病基因奠定了基础。     

河南省小麦条锈菌特异性SSR标记的筛选

为了简便地进行小麦条锈菌的早期检测,在前期工作的基础上,以小麦条锈病、叶锈病、白粉病的病叶和健康叶片为实验材料,采用来自条锈菌的SSR引物进行河南省小麦条锈菌的分子检测。结果表明, 在所用的条锈菌特异性SSR引物中,发现有4对引物能够将条锈菌和其他的病原菌区分开来。通过对来自河南省不同地区的小麦条锈病和叶锈病病叶的鉴定,其中2对引物 RJ3、RJ21的稳定性和可重复性均较好,表明这2对引物可以用于小麦条锈菌的分子检测。     

小麦白粉病菌对嘧菌酯和三唑酮的敏感性反应

为了解小麦白粉病菌对嘧菌酯和三唑酮的敏感性差异,采用与田间实际用药条件相似的离体叶段喷雾法比较了2014年河南、河北麦区的小麦白粉病菌对嘧菌酯和三唑酮的敏感性。结果表明,供试菌株对三唑酮的EC₅₀为53.93 mg·L^-1,抗性水平为15.14,抗性频率高达93.57%;对嘧菌酯的EC₅₀为0.235 mg·L^-1,抗性水平为0.539,未发现嘧菌酯抗性菌株。嘧菌酯对三唑酮敏感菌和抗药菌的毒力分别是三唑酮的59倍和1 396倍。嘧菌酯与三唑酮之间无交互抗性,可见嘧菌酯具有防治小麦白粉病的应用前景。     

小麦抗白粉病基因 Pm4的分子标记辅助育种研究

Pm4是我国目前有效的小麦抗白粉病基因之一,该基因对陕西关中当前流行的白粉病菌系关中4号表现高抗。本研究利用与Pm4基因紧密连锁的STS470分子标记对7个小麦品种间的6个杂交组合F3代单株进行分子标记检测并结合田间抗性鉴定筛选出抗病单株14个。对由这14个单株衍生出的64个F5代品系进行分子检测和田间抗性鉴定,发现53个品系表现抗病,占总品系的82.81%,其中51个抗病品系可以检测到与Pm4基因紧密连锁的STS470特异带,占总品系的79.69%。本研究结果表明,STS470是Pm4基因的可靠标记,可有效的用于分子标记辅助育种。     

高抗白粉病和条锈病小麦-卵穗山羊草衍生后代1003的分子细胞遗传学鉴定

卵穗山羊草中蕴含着许多小麦改良所需的优良基因,是小麦重要的三级基因库。为了解其更多遗传特性,本研究利用细胞学、原位杂交、分子标记、形态学和抗病性鉴定等技术对小麦-卵穗山羊草SY159的衍生后代1003进行鉴定。细胞学鉴定结果表明,1003含有44条染色体,减数第一次分裂中期含有22个二价体且配对良好,减数第一次分裂后期含有44条染色体且均等分离;基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization,GISH)分析显示,1003含有42条小麦染色体和2条卵穗山羊草染色体;EST和PLUG分子标记分析表明,导入的染色体属于7M染色体;荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)分析表明,1003中含有38条与中国春标准核型相一致的染色体,4A、5A和7M的FISH信号有变异;苗期抗病性鉴定结果表明,1003对白粉病生理小种E09免疫,对条锈病生理小种条中23(CYR23)高抗;形态学调查表明,1003的农艺性状介于双亲之间,千粒重高于双亲。因此,1003是一个具有白粉病和条锈病抗性的小麦-卵穗山羊草二体异附加系,可为小麦品种改良和抗病育种提供新的种质资源。