A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原,辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗,经一系列试验,确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1,血清的最佳稀释度为1∶100,血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST,兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明,阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体;与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应;批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%;100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好,可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

A型塞内卡病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种利用逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,从SVA细胞培养液中提取总RNA,根据SVA VP1基因序列,设计一套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP检测方法。利用建立的RT-LAMP检测方法对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒与塞内卡病毒进行特异性试验。将SVA VP1质粒10倍梯度稀释液作为模板(1×10~0～1×10~7拷贝)进行RT-LAMP和RT-PCR反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。采集疑似发病猪的鼻腔拭子和水疱液共126份样品,应用RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化鉴定。结果表明,与传统RT-PCR相比,RT-LAMP检测方法灵敏度高1 000倍,且与其他病毒无交叉反应,具有高度敏感性和特异性。临床样品检测结果显示,鼻腔拭子样本SVA阳性率为29.6%,水疱液样本SVA阳性率为100.0%,2种方法检测结果一致,符合率为100%。综上所述,本研究建立的RT-LAMP检测方法准确、简便、经济有效,尤其适用于现场和基层实验室对SVA的快速诊断。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白的表达及间接 ELISA抗体检测方法的建立

建立以传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白为诊断抗原的传染性法氏囊病(IBD)血清学检测方法,研究了VP2蛋白的编码基因,并在原核表达系统中表达了VP2蛋白。用表达的VP2蛋白建立了IBDV间接ELISA检测方法。抗原最佳包被量为每孔174.67 ng,血清最佳稀释度为1:40。对采自安徽部分地区的979鸡血清样品进行检测,IBDV抗体阳性率为39.73%。结果证实,间接ELISA法用于IBD血清抗体的监测具有良好的特异性,是一种快速简便的血清学方法,值得在基层推广应用。     

猪圆环病毒Ⅱ型特异抗体检测间接ELISA法的建立

利用巴斯德毕赤酵母表达的猪圆环病毒2型株Cap蛋白为包被抗原,成功地建立了一种检测血清中PCV-2特异抗体的间接ELISA方法.确定了血清样品阴、阳性判定标准.临床检测结果表明,自建ELISA试剂盒具有较高的敏感性和特异性.     

A型塞内卡病毒胶体金免疫层析抗原检测试纸的研制

为建立一种快速检测A型塞内卡病毒的免疫层析方法,本研究制备了SVA VP2蛋白的单克隆抗体,将单克隆抗体1D6作为金标记抗体,以单克隆抗体2C2和羊抗鼠Ig G分别作为检测抗体和质控抗体,用双抗体夹心原理制备了试纸条。结果表明,本研究所制备的2株单克隆抗体均具有良好的免疫活性,1D6和2C2识别不同抗原表位且具有较高的亲和力。基于单克隆抗体1D6和2C2制备的免疫层析试纸条能特异性的检测A型塞内卡病毒且与PRRSV、FMDV和SFV无交叉反应;病毒的最低检测限为4.8×10² TCID₅₀/m L且具有良好的重复性;该方法与RT-PCR方法检测临床样品的一致率为100%。综上所述,本研究制备的SVA胶体金免疫层析试纸具有良好的检测性能,为临床上SVA的防控提供了快速、简便的方法。     

温度和酸性环境对A型塞内卡病毒稳定性的影响

A型塞内卡病毒(SVA)作为猪水疱性传染病的病原体之一,日益影响我国生猪养殖业的发展。为探究温度和酸性环境对SVA复制的影响,以CHN/SVA/HB/2018 SVA株作为研究材料,采用生物信息学软件对SVA衣壳蛋白的理化性质、热点残基、相互作用力等进行分析。将SVA病毒液在不同温度(4、25、37℃)及不同pH值(4.0、5.8、6.6、7.2)缓冲液中进行孵育,利用TCID₅₀和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对SVA进行稳定性分析。结果表明：SVA衣壳蛋白在特定条件下具有不稳定性且衣壳蛋白耐热性不高,蛋白质间通过弱相互作用结合而形成病毒颗粒。通过SVA热稳定和酸稳定的试验验证随孵育温度升高或pH值下降,SVA病毒颗粒稳定性显著下降。综上,SVA具有热不稳定性和酸不稳定性,为新型高效疫苗与热稳定保护剂的研发提供一定参考。     

猪细环病毒1型间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立一种检测猪细环病毒1型抗体的血清学方法。【方法】以猪细环病毒1型衣壳蛋白为包被抗原,筛选和优化抗体检测反应条件来建立一种检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,之后进行特异性和重复性试验,并进行初步临床应用检测。【结果】确定了检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法的各项最佳反应条件;对8种猪源病毒阳性血清的检测结果显示只有猪细环病毒1型阳性血清为阳性,显示出良好的特异性;批内变异系数均小于5%,批间变异系数均小于10%,显示出良好的重复性。对来源于北京和湖南地区的400份猪血清样品的检测结果显示,猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体阳性率为75.25%,PCR阳性率为71.00%,二者之间没有显著差异(P>0.05),表明这两个地区存在较多的的猪细环病毒1型感染。【结论】建立了一种特异性和重复性都良好的检测猪细环病毒1型衣壳蛋白抗体的间接ELISA,可用于猪细环病毒1型抗体的临床检测。     

鸭圆环病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操作简便,可以低成本、大规模地检测鸭圆环病毒抗体。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL~(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。     

猪FMDV的VP1结构蛋白特异性抗体间接ELISA的建立

以纯化的FMDV-VP1融合蛋白为抗原,建立了猪口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白间接ELISA检测方法.抗原包被浓度为10μg·mL-1时,血清最佳稀释度为1:40,通过测定30份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准.结果表明,该方法特异性强,重复性好;对216份送检猪血清用EUSA检测,阳性检出率为31.5%,阴性检出率为68.5%,与HA符合率为96.2%,表明建立的VP1结构蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性.     

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV）的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明：1）对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4 096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2）该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3）在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

猪流行性腹泻病毒血清IgG间接ELISA检测方法的建立

以大肠杆菌表达系统制备的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原S1D(1μg/mL)每孔100μL进行包被,利用HRP-兔抗猪IgG(1∶20 000)建立了检测猪血清中抗PEDV IgG的间接ELISA方法。阴性判断临界值(M+2SD)为0.632,批内和批间检测的平均变异系数分别为2.3%和3.1%,该方法与商品化的PEDV抗体间接ELISA检测试剂盒同时检测50份临床血清样品,均为阳性,上述结果表明该方法可用于PEDV血清IgG的临床检测。     

黄海希瓦氏菌单抗介导间接ELISA快速检测技术的建立

应用农业部海洋水产增养殖学重点实验室制备的特异性抗黄海希瓦氏菌Shewanella smarisflavi AP629单克隆抗体3D9作为一抗,以碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠Ig作为酶标二抗,建立了仿刺参Apostichopusjaponicus＂化皮病＂病原菌——黄海希瓦氏菌AP629的间接ELISA快速检测方法,并进行了条件优化。结果表明：抗原的最佳包被浓度为107个/mL,一抗工作的最佳稀释度为1∶32,病原菌的检测灵敏度为5×105个/mL。该方法特异性强,与希瓦氏菌属其它种类、弧菌和气单胞菌等均无交叉反应。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。     

猪2型圆环病毒间接ELISA检测方法研究

应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。     

羊伪结核抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立羊伪结核棒状杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】分别用不同浓度的伪结核棒状杆菌菌体抗原和培养上清可溶性抗原包被酶标板,用脱脂奶粉封闭酶标板,设置封闭时间分别为1.0,1.5和2h,再用不同稀释度的血清(1∶100,1∶200,1∶400和1∶800)与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性结果判定的临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行考察,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。【结果】选用伪结核棒状杆菌菌体为包被抗原,最佳包被抗原菌体密度为OD600=0.08,血清的最佳稀释度为1∶400,封闭时间为2h,阳性血清的临界值为0.329。该抗体检测方法可特异性地检测出伪结核阳性血清,羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清均呈阴性反应;组内,组间变异系数10%。该方法对临床样本的检测结果与实际患病状况一致。【结论】成功建立了伪结核抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性强、重复性好,可用于临床诊断和批量血清学检测。     

应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。