犬弓首蛔虫ITS1基因的克隆及序列分析

通过对国内5个犬弓首蛔虫株(T.canis)即GD株、CQ株、YN株、HN株和GZ株的rDNA的内转录间隔区Ⅰ(ITS1)序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在确定ITS1是否可作为T.canis分子分类的遗传标记。结果显示:GD株、CQ株、YN株、HN株和GZ株的ITS1序列基本一致,仅GD株有2个碱基的差异,HN株和GY株分别有1个碱基的差异;与GenBank中登录的T.canis(序列号为AB110024、AB110026)的ITS1序列同源性高达98.9%～99.4%。结果表明ITS1可作为分子标记用于T.canis与其它蛔虫的种间鉴定,但不适合用于T.canis种内遗传变异的研究,为进一步的分子遗传学和分子诊断学研究奠定基础。     

犬弓首蛔虫TcCPG1的表达及其与几丁质的结合特性

为探讨犬弓首蛔虫（Toxocara canis,T.canis）软骨素蛋白多糖TcCPG1的表达特征及其与几丁质的结合方式,为犬弓首蛔虫软骨素蛋白多糖的功能研究提供依据,笔者克隆T.canis软骨素蛋白多糖1基因（Tc-cpg-1）并原核表达重组蛋白TcCPG1,采用镍柱亲和层析技术对重组蛋白进行纯化,并与几丁质进行结合试验;采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）进行Tc-cpg-1基因的转录水平的性别和组织差异表达分析。结果显示：Tc-cpg-1基因编码区（coding sequence,CDS）的长度为1 251 bp,共编码417个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白TcCPG1以包涵体形式存在,相对分子质量大小约为70 ku;对表达条件进行优化后,以0.8 mmol·L^-1 IPTG于16℃诱导14 h时可获得大量目的蛋白;利用镍柱亲和层析纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白,与几丁质进行结合试验,验证了重组蛋白TcCPG1能够与几丁质结合;通过qRT-PCR对Tc-cpg-1基因转录水平的组织差异性进行分析,发现Tc-cpg-1在雌虫中高量表达,尤其在雌虫的生殖组织中表达量最高,表明Tc-cpg-1可能参与了T.canis雌虫的生殖过程,推测TcCPG1可能通过与卵壳中几丁质的相互作用从而影响T.canis的胚胎和生殖发育过程。     

犬体表犬弓首蛔虫虫卵的污染调查

对 30只肉用犬和护院犬以及 2 5只伴侣犬体表犬弓首蛔虫虫卵的污染情况进行调查 ,结果表明 ,肉用犬和护院犬的污染率为 30 % ,伴侣犬的污染率为 1 6% ,并以丙硫咪唑对患犬或带虫犬进行了驱虫试验 ,效果为 1 0 0 %。     

犬弓首蛔虫卵黄原蛋白基因的克隆及表达分析

为克隆犬弓首蛔虫(T.canis)的卵黄原蛋白(YP)基因,本研究根据T.canis cDNA文库中的EST数据,采用RT-PCR方法扩增T.canis的YP基因(TcF-YP),并克隆至pGEM-T载体中进行测序。测序结果表明,TcF-YP基因片段大小为492 bp,编码163个氨基酸残基。同源分析显示,TcF-YP基因与猪蛔虫的卵黄原蛋白基因同源性最高,为78%。同时对该基因在T.canis雌虫、雄虫和雌虫各组织的表达谱进行研究,结果显示TcF-YP基因只在T.canis雌虫中高量表达,是雌虫特异的基因。对雌虫各组织的基因表达谱分析显示TcF-YP基因在子宫和肠中高量表达,在卵巢中有极微量的表达。本实验为TcF-YP基因的功能研究奠定了基础。     

犬弓首蛔虫西宁株线粒体基因ND1和ND4序列分析

为了解犬弓首蛔虫在国内外的进化特点,从位于青藏高原的青海省西宁市城区流浪犬及宠物犬粪便中获取虫体,针对不确定性因素影响,采用降落PCR并作出相应调整,扩增出西宁株ND1和ND4基因片段,经DNAstar软件包比对序列同源性和进化关系分析发现,犬弓首蛔虫西宁株线粒体基因ND1和ND4大小分别为360、400 bp。与在线BLAST检索收集的国内外6条弓首属不同种基因序列进行序列同源性和进化关系比对发现:ND1基因片段与我国广东犬分离株的序列同源性最高,为99.5%;与日本犬分离株的同源性最低,为82.6%,甚至低于伊朗的猫分离株(88%)。进化关系上,ND1基因与广东珠处于进化树的同一分支上,ND4基因仅与广东犬分离株高度同源(99.5%),而与其他序列的同源性都很低。两个基因的进化树分析结果与序列同源性分析结果基本一致。不同种的序列在进化上不在同一分支,表明种属和地域差异可影响犬弓首蛔虫的进化特点。本研究证实,西宁株犬弓首蛔虫属于我国大陆流行的遗传分支,并非独立株。这为进一步针对青藏高原区域犬弓首蛔虫的分子遗传学和分子诊断学研究奠定了基础,同时为公共卫生防治提供了依据。     

犬弓首蛔虫与细小病毒混合感染的诊治

今年 5月 1日 ,我市珊瑚乡一户主购进了 50条 2 5月龄肉种犬 ,7ｄ后 ,犬陆续发病 ,至 5月 2 1日 ,共死亡 1 0条。经诊断为犬弓首蛔虫与细小病毒混合感染 ,现报告如下。1　临诊症状发病初期 ,体温 39 2～ 40 1℃ ,剧烈呕吐 ,排黄色水样粪便。后期 ,粪便呈蕃茄汁样 ,腥臭难闻 ,酱油色。呕吐次数逐渐减少 ,病犬脱水衰竭 ,卧地不起。体温下降 ,36～ 38℃ ,脉搏减慢 ,6 0～ 70次 /ｍｉｎ。2　剖检变化剖检 4条病死犬 ,心肌均松软 ;2只犬肺表面有出血点和暗红色的出血斑 ;胃内空虚 ,胃壁大弯部呈弥漫性出血 ;小肠中后段肠粘膜有大量大小不一的出…     

犬弓首蛔虫感染比格犬不同阶段肝circRNAs表达模式的分析

旨在探究终末宿主肝环状RNA （circRNAs）在犬弓首蛔虫诱导致病过程中的潜在调控作用。18只6~7周龄的比格犬被平均分为3组（感染后0.5 d组、感染后1 d组和感染后36 d组）,每组包括感染和对照各3只,分别于感染后对应的时间点收集肝样品。提取感染和对照组肝的总RNA,利用高通量RNA测序,构建circRNA文库,对差异表达的circRNAs进行分析,并对差异表达circRNAs的亲本基因进行GO注释和KEGG富集分析。随机选取9个差异表达circRNAs进行实时荧光定量PCR验证。结果显示,与对照组相比,在感染后0.5、1和36 d分别有94、103和84个犬肝的差异表达circRNAs。Venn图显示,3个感染阶段没有共同表达的差异circRNAs;GO和KEGG分析显示,差异表达的circRNAs参与了宿主肝免疫与炎症的相关通路,其中差异表达的circRNA novel_circ_0016108、novel_circ_0016184和novel_circ_0027468与犬弓首蛔虫引起的天然免疫相关;novel_circ_0002212参与了犬弓首蛔虫引起的肝炎症反应;novel_circ_0002212和novel_circ_0019907在宿主肝抵抗犬弓首蛔虫侵袭的过程中发挥作用。RT-qPCR验证结果显示大多数差异表达的circRNAs与高通量测序结果一致。结果表明,肝circRNAs在犬弓首蛔虫感染终末宿主的过程中发挥着重要作用,这为进一步探究犬弓首蛔虫与宿主之间的相互作用提供了新的信息,并且也为促进疾病干预措施的制定提供参考。     

犬弓首蛔虫雄虫cDNA文库构建及EST分析

为构建T.canis雄虫cDNA文库,采用Trizol法提取T.canis雄虫的总RNA,合成cDNA,连接到λTripEx2载体上,通过包装蛋白对连接产物的包装,接种到大肠杆菌XL-1-Blue中进行原始文库和扩增文库的滴度测定.经质量鉴定表明:初始文库的滴度为5.25×106 pfu·mL-1,扩增后文库的滴度为6.90×109 pfu ·mL-1.文库的插入片段大小在500～2 000 bp,平均片段大小为1 000 bp,重组率为99.47％.所有指标均显示已成功构建了T.canis雄虫的cDNA文库.利用该文库获得了189条5'有效表达序列标签(EST).对ESTs拼接后代表了101个Unigenes,含有27个Contigs和74个Singletons.其Unigenes在GenBank中的序列号为HO348195～HO348295.同源性分析检索到有56个Unigenes与已知基因同源,其中具有已知或推测功能的基因有40个,未知功能基因有16个,未比对上的基因45个.未比对上的基因与NR数据库中的蛋白序列没有任何意义的匹配,为研究中发现的新基因.这些结果为进一步开展犬弓首蛔虫功能基因及分子机制研究奠定了基础.     

湖南娄底市犬弓首蛔虫流行状况及线粒体cox1和nad4序列变异分析

为了解湖南省娄底市犬弓首蛔虫流行状况及虫株遗传变异情况,本试验于2021年3—9月对该地区368份犬粪便和104份环境(土壤和水源)样品的犬弓首蛔虫污染情况进行调查;对9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列进行扩增、测序与分析。结果显示：被调查的犬粪便和环境样品的犬弓首蛔虫虫卵检出率分别为13.59%(50/368)和18.27%(19/104);其中宠物犬(11.74%)较流浪犬(17.36%)来源粪便样品检出率低,公园来源土壤样品(9.09%)较小区来源样品(3.92%)检出率高;9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列长度分别为424 bp和1 197 bp,核苷酸序列同源性为99.4%～100.0%和98.7%～100.0%,与其他具有代表性蛔虫分离株对应序列同源性均低于90%;9个犬弓首蛔虫分离株线粒体cox1和nad4序列核苷酸多样性分别为0.007±0.002和0.006±0.003。结果表明湖南娄底市犬弓首蛔虫分离株遗传变异较低,但虫卵流行状况严重,且存在于公共环境中,对人类健康造成潜在威胁。     

RNA干扰abcg-5基因对犬弓首蛔虫感染性的影响

为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(ATP-binding cassette G5,ab-cg-5)的功能,通过体外合成Tc-abcg-5基因的特异性siRNA,利用RNAi技术对T.canis的成虫和虫卵进行干扰。结果显示,干扰24、48h后siRNA-744组Tc-abcg-5的相对表达量比siRNA-1020组和siRNA-432组显著性降低,表明siRNA-744有较高的沉默效率。采用电穿孔法和浸泡法对siRNA-744的递送效率进行比较,结果显示浸泡法更有利于将siRNA-744导入到T.canis虫卵内。用siRNA-744经浸泡法干扰T.canis感染性虫卵,经口灌服小鼠,感染后第7天对小鼠的脑、肝和肺组织进行病理学研究,结果显示RNA干扰使T.canis感染性虫卵的感染力下降,从而降低了肺、肝的病变程度。研究表明Tc-abcg-5基因可能通过影响虫卵的发育从而参与T.canis的生长、发育过程。     

犬弓首蛔虫线粒体cox1基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明我国犬弓首蛔虫(Toxocara canis)湖南分离株线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)的遗传变异情况,并用其与其它弓首蛔虫的pcox1序列构建进化关系。应用PCR扩增犬弓首蛔虫虫株的pcox1,将所获得的序列应用Mafft 7.122程序进行比对,然后用Phy ML 3.1程序ML法绘制种系发育树。本实验扩增所获得的pcox1序列长度一致,均为394 bp,种内变异在0~2.5%之间,种间差异为8.2%~11.6%。种系发育分析结果表明,12个犬弓首蛔虫分离株位于同一分支。由于犬弓首蛔虫pcox1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间鉴定检测研究的遗传标记,本研究结果为犬弓首蛔虫的分类、鉴定和群体遗传结构奠定了基础。     

犬弓首蛔虫与狮弓蛔虫混合感染的诊治

犬蛔虫病是犬的一种常见肠道寄生虫病,其病原包括犬弓首蛔虫和狮弓蛔虫,主要寄生于犬及犬科动物的小肠中。犬蛔虫感染常导致犬发育不良、生长缓慢、呕吐、下痢等,严重时可导致死亡。2013年12月份,江苏农牧科技职业学院实验动物房饲养的1只中华田园犬出现消瘦、呕吐、消化不良等症状,经诊断为犬弓首蛔虫与狮弓蛔虫混合感染。1病原弓首蛔虫,雄虫长50-110 mm,     

拜宠清和伊维菌素对自然感染犬弓首蛔虫临床药效比较

用伊维菌素和拜宠清分别对自然感染犬弓首蛔虫(Toxocara canis)的犬进行驱虫,以虫卵减少率和虫卵转阴率为指标判定驱虫效果,比较2种药物对犬蛔虫的驱虫效力。结果显示:从虫卵减少率和虫卵转阴率来看,第1次给药后第5、10、15天拜宠清组和伊维菌素组的虫卵减少率均超过95%,但在第1次驱虫15 d后的虫卵转阴率均不能达到100%。在第1次驱虫后2周进行第2次驱虫,驱虫后5～10 d虫卵转阴率均能达到100%。从排虫情况来看,伊维菌素组多在给药后6～8 d排虫,拜宠清组多在给药后2～4 d排虫。从剖检情况看,经两次驱虫,驱净率均能到达100%。研究表明,伊维菌素和拜宠清对犬弓首蛔虫均有很好的驱虫效果。     

狼仔犬细小病毒与犬弓首蛔虫混合感染的治疗

2005年6月末,黑龙江省佳木斯市水源山公园的5只77日龄狼仔陆续发病,通过临床症状观察和实验室检查,确诊为犬细小病毒与犬弓首蛔虫混合感染,通过采用注射高免血清、对症治疗、支持疗法及药物驱虫等综合防治措施,所有狼仔恢复了健康.现将治疗情况报道如下.     

犬弓首蛔虫性别相关基因Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在不同生殖器官中的差异表达分析

为对犬弓首蛔虫(T.canis)免疫抑制卵巢信息蛋白(Tc-iom)、卵黄原蛋白(Tc-vit)、酪氨酸蛋白激酶(Tctpk)和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(Tc-stp)四个性别相关基因进行差异表达分析。本研究采用SYBR Green I qRT-PCR方法检测Tc-vit、Tc-iom、Tc-tpk、Tc-stp在T.canis雌虫卵巢、输卵管、子宫和雄虫精巢、贮精囊、输精管的转录情况。结果显示,Tc-vit在雌虫卵巢、输卵管和子宫中均有转录,在雄虫精巢和贮精囊中也有转录,但在输精管中无转录;Tc-iom在雌虫卵巢、输卵管和子宫中高水平转录,在雄虫精巢和贮精囊中转录量较低,输精管中无转录;Tc-tpk在雄虫精巢和贮精囊中的转录明显高于其他生殖组织;Tc-stp在雄虫精巢和输精管中转录量较高,在雌虫卵巢、输卵管和子宫中转录量较低。本试验为T.canis性别相关基因的进一步研究奠定了基础。     

牛整合素α4亚基片段的原核表达及抗体制备

参照GenBank中牛整合素α4基因序列,合成了牛整合素α4亚基753bp（192～944nt）的cDNA片段,克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,转化入BL21,IPTG诱导表达。表达产物经Western blot鉴定,结果表明成功表达了相对分子质量约为30 000的α4蛋白。超声破碎细菌后,目的蛋白主要以包涵体形式存在。蛋白纯化后进一步复性,免疫大鼠获得多抗,间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶32 000。这为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定了基础。     

高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝...     

陕西省榆林地区犬弓首蛔虫的流行情况调查及其遗传多样性与种系发育关系分析

为了调查陕西省榆林地区犬弓首蛔虫的流行情况，并研究其基因变异、遗传多样性及种系发育关系，试验采用饱和盐水漂浮法对采自该地区的402份犬粪便进行虫卵检查，利用IBM SPSS Statistics 22软件对虫卵检测数据进行统计和分析，并采用χ²检验分析各地区、各类型犬感染犬弓首蛔虫的差异性；PCR扩增犬弓首蛔虫的cox1、18S rRNA基因序列并测序；运用Clustal X与DNAStar软件分析2个基因的碱基组成与遗传多样性；运用Clustal X及PhyML 3.0软件分析犬弓首蛔虫的种系发育关系。结果表明：陕西省榆林地区犬对弓首蛔虫的总感染率为20.65%,其中宠物犬的感染率为8.42%,而流浪犬的感染率为33.00%,各地区、各类型犬感染犬弓首蛔虫的情况存在一定差异；cox1基因序列长度为1 044 bp, A+T含量为61.5%～62.2%,G+C含量为37.8%～38.5%,种内差异为0～1.3%,种间差异为9.87%～14.37%;18S rRNA基因序列长度为598 bp, A+T含量为50.0%～50.5%,G+C含量为49.5%～50.0%,...     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。     

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD.将该质粒转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,...