高通量SNP芯片在牛体外早期胚胎染色体质量鉴定中的初步应用

旨在基于高通量SNP芯片建立一种可评估牛早期胚胎染色体质量和生产性能的方法,为胚胎牛育种提供技术支撑。本研究通过胚胎切割技术分别对荷斯坦奶牛体内囊胚(n=27)、体外囊胚(n=21)、体外2细胞胚胎(n=6)和8细胞胚胎(n=5)进行切割取样并统计发育率,其中体内囊胚组分为1/2体内胚组(切取半个胚胎)和体内滋养层(trophoblast cells, TE)组(切取体内胚胎少量TE),体外囊胚组、体外2和8细胞胚胎分别为体外TE组(切取体外胚胎少量TE)、体外2细胞(切取体外2细胞胚胎的1个卵裂球)和8细胞组(切取体外8细胞胚胎的1个卵裂球)。切割取样后进行全基因组扩增(whole-genome amplification, WGA),对扩增成功且DNA量大于1 000 ng的样品进行SNP芯片检测,芯片检出率大于90%的进行生产性能评估,低于90%的进行染色体片段缺失分析和数据填充。结果显示：1)切割部分TE后,体内TE组剩余部分和体外TE组剩余部分继续培养24 h后的发育率分别为(94.4±5.6)%和(90.5±6.6)%,而1/2体内胚组剩余部分的发育率显著降低,仅为(22....     

云南黑山羊性别决定基因体外扩增研究

对云南黑山羊 (10♂ ,2♀ )的基因组DNA性别决定基因 (SRY)进行了体外PCR扩增的研究 ,结果表明适当引物可特异性扩增出雄性个体的性别决定基因片段 (大小约为 185bp) ,而对雌性个体则不能扩增出任何片段 ;研究还利用已筛选出的性别决定基因特异性引物对少量的胚胎细胞进行了特异性扩增 ,检测了 2 0枚云南黑山羊的胚胎 ,其中有 5枚胚胎可扩增出约为 185bp的特异性片段。以上结果为山羊胚胎早期性别鉴定奠定了技术基础。     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立

根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析。结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定。巢式PCR,公兔基因组DNA扩增出282bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24)。SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物。     

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

牛体外胚胎高效生产技术优化研究

为了探讨小卵泡液、放线菌酮(CHX)对卵母细胞预成熟、囊胚滋养层细胞囊泡(TVS来源于体外受精培养14 d的滋养层细胞)、维生素对牛体外胚胎质量的影响。在B超仪下进行牛活体取卵(OPU),从牛活体卵巢采集卵母细胞,进行体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养。结果表明:10%小卵泡液及8%CHX的卵母细胞预成熟4 h组显著优于对照组;在体外受精及早期胚胎培养液CR1aa中添加10μg/m L维生素C组与TVS共培养组的卵裂率和囊胚发育率均高于其他试验组(P0.05);体外胚胎与TVS共移植受胎率显著高于对照组(P0.05)。说明活体采集的卵母细胞经体外预成熟处理,可以达到核质同期化的目的,早期胚胎的培育过程中加入TVS、抗氧化剂等可以克服早期胚胎的发育阻滞,提高体外胚胎的囊胚发育率。     

牛早期胚胎的性别鉴定PCR技术的研究

根据牛SRY(Y-染色体性别决定基因)基因序列自行设计合成3对常规PCR引物作为牛性别鉴定特异性引物,对15头公牛、20头母牛的样品进行检测.结果表明,第2对引物可清晰扩增出公牛基因组DNA750 bp左右条带,而母牛基因组DNA无此扩增条带,证明这条引物可以应用于牛的早期胚胎性别鉴定研究与应用.     

成纤维生长因子4在妊娠早期牛胎盘组织的分布及表达特点

成纤维生长因子4(FGF4)是在哺乳动物胚胎发育过程中第一个被发现的FGF分子,在促进滋养层细胞的增殖方面具有广泛的作用。已经证实,FGF4是小鼠早期胚胎发育过程中的一个重要因子,异常表达会影响早期胚胎的发育,并影响小鼠胎盘的发育及功能。截至目前,有关FGF4在牛胎盘发育过程中的表达尚无报道。本试验运用石蜡切片HE、PAS、免疫荧光染色技术和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对妊娠早期牛胎盘组织结构特征及胎盘组织中FGF4的细胞定位和mRNA表达规律进行研究。结果显示,在所检测的各胎龄胎盘的羊膜、子叶及肉阜组织均检测到Fgf4 mRNA,各部位表达量依区域和孕龄而异;在牛胎盘块的单核滋养层细胞、滋养层巨细胞、肉阜上皮、子宫内膜上皮及子宫腺等部位的细胞质均观察到FGF4阳性反应,滋养层巨细胞及子宫腺上皮呈强染色。可见,在妊娠早期的牛胎盘组织存在FGF4及其mRNA,随着胎龄的增加其表达量在胎儿胎盘(子叶)表现为先降低而后增高的规律,而在母体胎盘(肉阜组织)则呈现先逐渐升高然后降低的趋势。     

IVF牛胚的活检和性别判定

取16—32细胞期胚胎的单个卵裂球,利用PCR技术进行牛胚性别鉴定。试验牛胚是体外受精胚,在受精后第5天进行活检,活检胚培养在颗粒细胞单层上。PCR采用了1对牛特异引物和1对Y染色体特异引物,PCR扩增后有一条带者为雌,2条带者为雄,结果95.4％样品给出了明确的信息,表明早期牛     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明：第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA元此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明:第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA无此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

布鲁菌糖基转移酶对细胞炎症反应的影响

本研究旨在研究布鲁菌糖基转移酶(WboA)在诱发胚胎滋养层细胞(HTP-8)炎症反应中的作用。以羊种布鲁菌M5-90为模板,扩增WboA基因,构建pET28a(+)-WboA重组表达质粒,转化重组质粒在BL21(DE3)中表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,并对重组WboA蛋白进行纯化。构建自杀载体pGEM-7zf-ΔWboA-SacB,通过同源重组的方法,筛选布鲁菌WboA基因缺失株ΔWboA,并进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。然后将纯化的WboA蛋白与ΔWboA分别作用于胚胎滋养层细胞,ELISA检测IL-6、IL-10、TNF-α和乳酸脱氢酶(LDH)的相对变化量。结果成功纯化了WboA蛋白,构建了ΔWboA,ΔWboA侵染胚胎滋养层细胞诱导产生炎症细胞因子IL-6、IL-10和TNF-α均低于M5-90对照组,差异显著(P<0.05),WboA蛋白作用胚胎滋养层细胞时,炎症细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著(P<0.01)。本研究表明WboA蛋白具有细胞毒作用,布鲁菌的致炎作用与脂多糖O链相关,为进一步阐明布鲁菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。     

玻璃化冷冻牛GV卵母细胞全基因组甲基化模式初探

旨在研究玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞全基因组甲基化的影响。本研究收集新鲜、玻璃化冷冻的牛GV卵母细胞,采用单细胞全基因组甲基化测序(ScWGBS)技术对新鲜、玻璃化法冷冻牛GV卵母细胞的全基因组甲基化水平进行检测,旨在揭示两者DNA甲基化模式的差异。结果表明,玻璃化冷冻不会对牛GV卵母细胞的全基因甲基化水平造成显著影响。基于基因本体(GO)和信号通路(KEGG)对140个差异甲基化区域(DMRs)进行分析,发现DMRs主要参与细胞发育、细胞骨架组织等功能,主要富集在PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路等,并筛选出与卵母细胞成熟(TSC2)、细胞骨架(NUDC)、细胞活力(MAFK)等相关的基因。上述结果,可为提高GV卵母细胞玻璃化冷冻效率奠定信息基础和研究方向。     

PCR法鉴别牛早期胚胎性别的研究进展

对PCR法鉴别动物胚胎性别的机理进行了分析,综述了近10年来相关操作技术的进展,包括早期胚胎取样、胚胎细胞DNA的提取、引物的设计、扩增条件的优化、扩增产物的检测和性控胚胎的冷冻等,并提出PCR法鉴别牛早期胚胎性别的前景与展望。     

宁夏地区青年荷斯坦母牛基因组育种值分析

本研究旨在进行青年母牛的早期选育工作,为快速扩繁生产优秀胚胎提供早期选择供体牛的标准。首先利用宁夏荷斯坦牛DHI、体型鉴定数据库计算母牛CPI值,排队筛选其6月龄后代女儿,利用Bovine SNP54K或150K芯片并借助中国荷斯坦牛全基因选择技术平台对SNP效应进行估计、计算青年母牛GEBV,结合中国荷斯坦牛基因组选择指数,筛选利于快速扩繁的胚移供体牛。结果表明,三批次筛选评定的青年母牛基因组育种值平均可靠性60%,平均GCPI值分别为283.32、438.3、589。本研究结果可以作为宁夏优质高产奶牛选育项目的青年母牛早期选育标准,下一步将结合检测牛只的生产性能数据,开展进一步分析和验证。     

牛早期胚胎性别快速鉴别的研究

根据聚合酶链式反应中聚合酶的扩增特性,对PCR反应的循环参数进行研究,取消了PCR反应中延伸这1温度梯度,对2温度梯度PCR方法进行了单重PCR和多重PCR扩增研究,并采用2温度梯度多重PCR方法分别对牛基因组、成纤维细胞、胚胎样品进行了性别鉴别研究,建立了稳定、简便、快速的用于牛早期胚胎性别鉴别的2温度梯度PCR方法.同时还对2温度梯度PCR的扩增能力进行了研究,结果表明：2温度梯度PCR方法能够扩增片段的可能长度为633 bp.     

微量牛卵中H1foo CDS序列的克隆及其mRNA向卵内显微注射

本研究旨在优化从微量卵中克降基因的条件,并构建牛H1foo基因真核表达载体.首先将微量(1～5个)卵母细胞裂解后,用改进的RT-PCR方法扩增内参β-actin基因以检测该方法扩增基因的效率,结果表明单卵扩增成功率为80%以上(10/12),3个、5个卵扩增成功率均达100%.利用该体系从微量(5个)牛卵中克隆得到H1fooCDS全长序列,测序结果显示其与GenBank上公布序列同源性为100%.将牛H1foo CDS连接至pMD19-T载体上,经酶切、测序鉴定正确后定向亚克隆到真核表达载体pVenus上,鉴定正确后命名为pVenus-H1foo.利用脂质体2000将pVenus-H1foo转染Hela细胞,24 h后通过荧光显微镜观察、RT-PCR、Western Blotting分别检测表明其能够正确表达.将H1foo体外转录为mRNA后直接注射卵母细胞,其表达产物能准确定位于卵母细胞及极体的染色体上.结果,成功构建了牛H1foo真核表达载体pVenus-H1foo,为研究该基因在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础.     

不同PCR法对牛性别鉴定的影响研究

为建立一种有效的牛早期胚胎PCR性别鉴定方法,试验以12头已知性别的牛全血为试验材料,提取基因组DNA,分别运用常规PCR法、多重PCR法和巢式PCR法进行牛性别鉴定研究,用2对SRY(Y染色体性别决定区)引物和1对牛特异性引物扩增牛核基因组DNA进行牛性别鉴定,建立3种牛性别鉴定的PCR反应体系。结果表明,3种方法准确率均为100%,其中巢式PCR法检测灵敏度可达13pg,多重PCR法整个鉴定过程约需3h。     

不同方法提取猪和牛卵母细胞和早期胚胎 total RNA的比较

研究以猪和牛GV期的卵母细胞和8细胞期胚胎作为研究对象,分别用QIAGEN RNeasy Micro Kit、无根RNAPrep Micro kit和华舜快速RNA(微量)提取试剂盒提取其中的total RNA,通过对total RNA的浓度和纯度的分析比较,找出较适宜的提取方法.结果显示,QIAGEN RNeasy Micro Kit 能更有效地从少量猪和牛卵母细胞和早期胚胎中提取高质量的total RNA.     

牛体外受精胚胎早期发育过程中基因差异表达的研究

本研究旨在筛选牛体外受精胚胎早期发育差异表达基因,并进行差异表达分析。选取牛卵母细胞、体外受精8细胞期和囊胚期胚胎为试验材料,进行mRNA差异表达研究。初步克隆出4个牛卵母细胞和早期胚胎发育不同阶段差异表达的基因,同源性分析显示,它们分别与高移动样蛋白盒结构域4基因(HMGXB4)、热休克蛋白40亚家族C成员8基因(Dnajc8)、突触膜胞吐调节2基因(RI MS2)和核糖体蛋白L31基因(RPL31)高度同源。RT-PCR检测验证,HMGXB4、Dnajc8、RI MS2和RPL31在牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中mRNA表达量存在时间性差异,可能与其参与不同的生理活动有关。