西瓜噬酸菌hflX基因功能分析

为明确GTP结合蛋白基因hflX在西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli中的功能尤其是对该菌致病力的影响,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为材料获得hflX基因的缺失突变菌株及互补菌株,通过对致病力等表型以及相关基因表达量的测定初步探究西瓜噬酸菌hflX基因的功能。结果显示,同野生型菌株Aac5相比,缺失突变菌株的致病力显著下降,III型分泌系统基因hrpG和hrpE的表达量显著下调,仅为野生型菌株表达量的54.99%和27.39%;hflX基因的缺失并未影响其引起烟草过敏性坏死反应的能力;但缺失突变菌株的运动能力显著下降,鞭毛基因fliR和fliC的表达量显著下调,仅分别为野生型菌株的37.04%和29.68%。此外,缺失突变菌株的生物膜形成能力相较于野生型菌株显著增强了26.32%,同时,其体外生长能力也有所增强。表明hflX基因可能通过调控III型分泌系统基因hrpG和hrpE、鞭毛基因fliR和fliC的表达以及运动能力来影响西瓜噬酸菌Aac5菌株的致病力。     

西瓜噬酸菌中C-di-GMP代谢相关基因Aave_2620的功能研究

 环鸟苷二磷酸(cyclic diguanylate,c-di-GMP)是一种广泛存在于植物病原细菌中的第二信使,调控细菌多种生物学功能,从而影响病原细菌的致病性,但其在西瓜噬酸菌中的研究还未见报道。本实验以Aac5菌株为研究对象,通过构建c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620缺失突变株和互补菌株,从其致病能力及其生长能力两部分进行测定,探究此信号途径是否在西瓜噬酸菌中调控致病机制。结果表明,基因Aave_2620的缺失显著降低Aac5菌株致病力、生物膜形成能力和生长能力,减弱烟草过敏性反应以及运动能力,互补菌株表型基本得到恢复。基因Aave_2620的缺失显著影响三型分泌系统相关基因、毒性相关基因以及鞭毛及趋化性相关基因在西瓜噬酸菌中的表达量。以上结果表明c-di-GMP代谢相关基因Aave_2620与西瓜噬酸菌的致病密切相关。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcQ基因功能分析

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)是影响西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病性的重要因素,hrcQ作为T3SS的保守基因,在组成和维持该系统功能方面扮演着重要角色,但hrcQ在西瓜噬酸菌中的具体生物学功能尚不明确。本试验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过基因敲除、致病力及相关表型测定等,解析了hrcQ基因的功能。结果表明:hrcQ缺失导致Aac5菌株对寄主的致病能力丧失,运动性及生物膜形成能力降低,并丧失了引起烟草过敏性反应能力;hrcJ和hrcR基因在hrcQ缺失突变株中的表达量下调,hrcQ对hrcJ和hrcR基因均为正调控。表明hrcQ在维持西瓜噬酸菌致病能力中起着不可或缺的作用。     

西瓜噬酸菌Ⅲ型分泌系统hrcS基因功能分析

为明确编码Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,T3SS）中重要核心蛋白的hrcS基因对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli致病力的影响,以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac5为对象,通过基因敲除构建hrcS基因缺失突变菌株ΔhrcS及其互补菌株ΔhrcS-comp,测定其致病力及致病相关基因表达量、烟草过敏性反应能力、运动能力及运动能力相关基因表达量、生物膜形成能力和离体生长能力。结果显示,与野生型菌株Aac5相比,hrcS基因缺失突变菌株丧失了对寄主的致病能力和引起非寄主烟草过敏性反应能力,运动能力显著增强了191.75%,生物膜形成能力显著下降了43.90%,离体生长能力在达到对数期后呈下降趋势。hrcS基因缺失使西瓜噬酸菌T3SS中hrpG、hrpX和hrpE基因以及鞭毛fliC基因表达量显著上调,分别为野生型菌株的2.27倍、2.38倍、1.26倍和1.77倍,hrcQ基因表达量显著下调,仅为野生型菌株的50.75%。表明hrcS基因在维持西瓜噬酸菌致病能力中发挥着重要作用。     

西瓜噬酸菌Aac-5AAA ATPases基因moxR和ruvB功能研究

AAA ATPases(ATPase associated with diverse cellular activities)是一种与细胞活性相关的酶,广泛存在于所有生物中,同时具有蛋白酶和分子伴侣活性。为了研究AAA ATPases相关基因缺失对西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)的影响,本研究通过同源重组双交换的方法构建西瓜噬酸菌moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株及互补菌株,测定了突变菌株的致病性、烟草过敏反应、运动性、生长能力、生物膜形成等;并利用实时荧光定量PCR方法测定了AAA ATPases与Ⅲ型分泌系统相关基因(hrc N和hrp E)、毒性蛋白相关基因(trb C和vir B)、鞭毛相关基因(fliR和fli M)、菌毛相关基因(pin C-1和pin C-2)以及AAA ATPases亚家族Ruv B相关基因(ruv A和ruv C)的关系。结果表明,moxR基因以及ruv B基因全缺失突变菌株的致病力降低、运动性减弱、生长能力下降、生物膜形成能力增强、烟草过敏性反应减弱、突变菌株中重要的致病基因hrc N和hrp E表达量显著下调,表明AAA ATPases相关基因moxR、ruv B在西瓜噬酸菌的致病力上发挥重要作用。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌ftsH基因功能分析

 AAA ATPase (ATPase associated with diverse cellular activities) 在西瓜噬酸菌的多种生命过程中发挥重要作用。AAA家族中的FtsH蛋白(filamentation temperature-sensitive H)是由ftsH基因编码的,参与生长、致病、环境应激反应、膜内在蛋白质量控制等过程的蛋白,但其在西瓜噬酸菌中的作用尚未明确。本实验以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,通过构建基因缺失突变体,测定致病力等各项表型以及突变株中致病相关基因和其他AAA ATPase基因的表达量,初步探索西瓜噬酸菌中ftsH的功能,为FtsH蛋白的功能研究奠定基础。结果表明,ftsH缺失显著降低菌株致病力、运动能力、生物膜形成能力、生长能力和环境胁迫耐受能力,不影响烟草过敏性反应,显著影响西瓜噬酸菌致病相关基因、AAA ATPase基因以及热激转录因子σ³²的表达量。这表明ftsH基因的功能与西瓜噬酸菌的致病性和环境耐受性密切相关。     

西瓜噬酸菌MarR家族转录因子Aave_3922的功能研究

 MarR(Multiple antibiotic resistance regulator)家族转录因子是一种广泛存在于细菌及古细菌中的转录抑制子。MarR可通过调控毒力因子的表达来影响病原细菌的致病性,其调控机制独特,在不同菌中存在不同的调控网络。为明确其在西瓜噬酸菌中的功能及信号通路,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,构建MarR转录因子Aave_3922的缺失突变株及互补菌株,通过对表型及转录水平的测定,初步探究西瓜噬酸菌中MarR转录因子的功能及可能的调控网络。结果显示,与野生型Aac5菌株相比,突变菌株致病能力、生物膜形成能力、体内生长能力均显著下降,互补菌株有所恢复。同时,基因Aave_3922的缺失会显著影响三型分泌系统关键基因hrpX及hrcJ、毒性相关基因trbC、鞭毛及趋化性相关基因fliC及cheA、生物膜相关基因Aave_2620在西瓜噬酸菌中的表达量;与WT-hrpXpGUS相比,ΔAave_3922-hrpXpGUS的启动子活性显著减弱。以上结果表明Aave_3922基因可能通过参与hrpX的转录调控,以及调控生物膜形成来影响西瓜噬酸菌的致病能力。     

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,控制细菌的毒性和蛋白泌出。本试验构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。与野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失导致了突变菌株运动能力显著增强,在接种前期突变株病情指数明显下降;通过qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,其中popA、popB和popP基因表达量上调,而popC表达水平下调。T6SS基因簇的缺失影响了Po82菌株的运动能力和Ⅲ型效应子基因的表达,使得Po82病程延长。这些结果说明,T6SS参与青枯菌的致病过程,且T6SS与T3SS之间有复杂的未知调控关系。     

青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

hrcN是植物病原菌Ⅲ型分泌系统基因（T3SS）的结构基因之一,对病原菌的致病力有重要影响。本研究克隆青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因并作生物信息学分析,结果显示该基因长度为1320 bp,共编码439个氨基酸,预测HrcN蛋白无信号肽,无跨膜区域,整体呈弱亲水性,该蛋白为ATP酶,定位于细胞内膜和细胞质。基因敲除结果显示,菌株CBM613的hrcN突变体与野生型菌株在富营养培养基上的生长速率差异不明显,而在贫营养培养基上前者的生长速率显著快于后者。敲除hrcN基因后,青枯雷尔氏菌的运动能力无明显变化,生物被膜形成能力显著降低。以敲除突变型和野生型青枯雷尔氏菌株接种番茄,与后者相比,前者的致病力下降,病情指数降低,病程延长,但并未完全丧失致病力,表明hrcN基因是青枯雷尔氏菌致病性相关的重要基因。本研究为进一步探索青枯雷尔氏菌致病机制及防治具有重要意义。     

青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏...     

植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统中hcp基因的克隆及其功能研究

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是新近报道的细菌蛋白分泌系统。基于植物青枯菌致病力分化菌株Po82的全基因组测序结果,发现其大质粒中存在T6SS的同源基因簇。本文通过基因敲除的方法构建了Po82菌株Ⅵ型分泌系统中的核心基因—hcp基因的缺失突变株,并比对了Po82野生型菌株、突变株及互补菌株在致病性、生长速率、运动性、生物膜形成等方面的变化。结果表明,hcp基因突变株较野生型菌株致病力显著减弱,病程延长;在生长速率、运动性及生物膜形成方面,突变株较野生型无明显差异。说明植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因参与了细菌的致病过程。     

西瓜噬酸菌铜代谢相关基因copZ功能分析

 瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)病原菌为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac),主要为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,是瓜类生产上主要细菌性病害。目前生产上对该病害的防治手段主要以化学防治为主,其中铜制剂的防治效果较为显著。本研究以西瓜噬酸菌野生型菌株Aac-5中铜代谢相关基因copZ为对象,探究copZ基因缺失对西瓜噬酸菌抗铜性、生长能力等表型的影响;采用RT-qPCR技术测定在不添加和添加外源铜离子条件下,基因copZ缺失后对其他铜代谢相关基因表达量的影响。成功构建了西瓜噬酸菌copZ基因缺失突变菌株ΔcopZ和互补菌株ΔcopZ-comp。结果表明,野生型菌株Aac-5与ΔcopZ-comp菌株在添加1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的生长能力与不添加CuSO₄相似,而ΔcopZ菌株的生长能力减弱;当添加CuSO₄至2.50 mmol·L^-1时,野生型菌株Aac-5、ΔcopZ菌株和ΔcopZ-comp菌株的生长能力均减弱。基因copZ缺失在不含铜和含铜条件下均能使西瓜噬酸菌生物膜形成能力减弱;在不含铜条件下基因copZ不影响西瓜噬酸菌的运动能力,在含有1.25 mmol·L^-1 CuSO₄的运动性培养基中各菌株运动能力丧失。ΔcopZ菌株在西瓜子叶内的生长能力相较于野生型菌株Aac-5显著增强,但在西瓜幼苗上的致病力差异不显著,仍具有引起烟草过敏性反应的能力。在不同铜浓度处理后,铜代谢相关基因cueR、copA表达量在野生型菌株中的变化趋势与ΔcopZ菌株存在差异;基因cusA、hylD在野生型菌株中表达量变化趋势与ΔcopZ菌株一致。这表明基因copZ在西瓜噬酸菌铜代谢过程中具有重要作用。     

青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系统调控基因hrpB的功能研究

本文以青枯菌致病力分化菌株Po82的Ⅲ型分泌系统调控基因hrpB为研究对象,采用同源重组双交换法,构建获得青枯菌Po82菌株的hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB及其互补菌株Po82ΔhrpB-pML123-hrpB,并对野生型菌株、突变株和互补菌株进行了致病力及生物学功能的验证。致病力测定结果表明,青枯菌hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB的致病力较Po82野生型菌株显著下降,而互补菌株Po82ΔhrpB-pML123-hrpB能够部分恢复突变菌株的致病力。生长曲线测定结果表明,在营养贫瘠型培养基中,hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB的生长速率较野生型青枯菌Po82菌株快,但是在营养丰富型培养基中,两者生长速率基本一致。野生型和突变株的运动性测定结果显示,两者的运动性无显著差异。表明hrpB基因在青枯菌致病过程中具有重要影响,并对进一步发掘鉴定Po82菌株中新的Ⅲ型效应子,进而深入解析其致病力分化的分子机理具有重要的作用。     

西瓜嗜酸菌LuxR家族基因luxR_(4229)的功能研究

瓜类细菌性果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害,其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)。本研究以野生型菌株Ac-5为研究对象,通过同源重组双交换的方法,构建了LuxR家族功能基因luxR_(4229)的全基因缺失突变株,并对突变株进行致病性、生物膜形成能力和运动能力等生物学特性测定。同时,qRT-PCR定量检测了鞭毛基因fliR和fliC以及III型分泌系统功能基因hrpE和hrcN的表达水平。结果显示:与野生型相比,突变株致病力明显降低,运动能力减弱,而生物膜形成能力增强。fliR、fliC、hrpE和hrcN基因在突变株中的表达量下调,luxR4229对fliR、fliC、hrpE和hrcN基因均为正调控。基因luxR_(4229)在对西瓜嗜酸菌致病力、运动能力及生物膜的形成具有重要调控作用。     

甜瓜细菌性果斑病菌致病性突变体筛选与hrcR基因的克隆

 细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB)是西瓜和甜瓜的重要病害。本实验从发病甜瓜果实上分离得到致病菌株MH21,经鉴定为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli)。利用转座子Mini-Tn5构建MH21菌株的突变体库,Southern印迹杂交结果显示Mini-Tn5在菌株MH21染色体上可随机、单拷贝插入。通过浸种处理甜瓜种子进行突变体的致病性检查,筛选得到1株致病性完全丧失的突变体M543。对M543中转座子插入基因的克隆和测序表明其突变基因为燕麦食酸菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)中的保守基因hrcR。推测菌株MH21中hrcR基因编码的蛋白定位于细菌内膜,是分泌通道主要成分之一。hrcR基因互补菌株的致病性检查结果显示其致病力恢复到野生型的84%。研究同时发现hrcR基因突变后MH21菌株丧失了在烟草上诱导过敏性坏死反应的能力。本研究从遗传学角度说明TTSS是西甜瓜果斑病菌致病性的重要因子。     

基于多重PCR技术的西瓜噬酸菌分组检测方法及其应用

瓜类细菌性果斑病是瓜类作物上重要的种传细菌性病害,其病原菌西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli为我国进境植物检疫性有害生物,种子种苗带菌是病害长距离传播的重要来源,种子种苗的快速检测对病害综合防控具有重要的意义。根据寄主的差异西瓜噬酸菌分为两个组,Ⅱ组菌株比Ⅰ组菌株具有更高的铜制剂敏感性,因此,西瓜噬酸菌的分组检测可为病害田间防治中铜制剂的精准使用提供科学依据,避免化学农药的过量施用。本研究筛选了现有的西瓜噬酸菌种间特异性引物和种内分组特异引物,建立并优化了一个多重PCR体系,实现了通过一步试验,就能够准确将西瓜噬酸菌与近缘种和其他植物病原细菌区分开来,并直接鉴定到西瓜噬酸菌不同组。该多重体系可以从带菌种子浸泡液和感病植物组织研磨液中直接检测到西瓜噬酸菌的不同组,且稳定性好,具有应用于生产实践的潜力。     

细菌分泌系统与茄科雷尔氏菌致病机理的关系研究进展

青枯病(bacterial wilt)的致病菌茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum主要通过Ⅲ型及Ⅱ型分泌系统等将多种毒性因子输送到细胞外而使寄主植物致病。主要综述了近年来茄科雷尔氏菌Ⅲ型和Ⅱ型分泌系统的Phc、Prh、EPS和Peh 4个调控网络与该病原菌致病性之间的关系,以及2个分泌系统相互之间的关系。可为进一步研究该病害的作用机理及寻找其致病性靶标提供参考。     

瓠瓜果斑病症状及其病原菌的鉴定

为有效防控瓠瓜果斑病,自浙江省象山县田间采集具有典型果斑病症状的瓠瓜样本,对其进行病原菌分离、形态观察、致病性测定及分子生物学鉴定,并利用特异性引物PL1/PL2 PCR扩增和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry,MALDI-TOF-MS）技术对其病原菌进行亚群鉴定。结果表明：瓠瓜果斑病田间典型症状是发病叶片和果实上病斑由水渍状小斑点逐渐发展为伴有黄色晕圈的褐色不规则病斑,果实腐烂、有臭味。通过菌体形态和培养特性观察、PCR鉴定、16S rDNA序列分析和7个看家基因的系统发育分析将其病原菌鉴定为西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli。从瓠瓜上分离的菌株均属于西瓜噬酸菌亚群I,从西瓜上分离的菌株均属于西瓜噬酸菌亚群II。     

利用酵母双杂交筛选与致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586互作的寄主蛋白

 致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的病原菌,其分泌的效应蛋白是侵染寄主的重要毒力因子。本研究在致病疫霉转录组中筛选到一个侵染早期表达的效应蛋白基因PITG_07586(GenBank:XM_002904522.1)。该基因全长447 bp,其编码蛋白包含1个信号肽,1个核定位信号序列(RRRRKRRKKKK)。在本氏烟草中,瞬时表达该基因显著促进病原菌侵染。亚细胞定位表明GFP-PITG_07586定位在细胞核中。利用酵母双杂交技术并以PITG_07586为诱饵筛选马铃薯cDNA文库,最终获得3个靶标蛋白。经序列比对分析,这3个靶标蛋白分别是马铃薯POM30蛋白、电压依赖阴离子通道蛋白VDAC以及SRC2类蛋白。研究结果为致病疫霉菌效应蛋白PITG_07586及其靶标蛋白如何调控植物免疫提供重要依据。