3β-HSD在初情期从江香猪附睾中的特异性表达模式

3β-羟基甾脱氢酶（3β-HSD）特异性表达于从江香猪的附睾组织中,并且在初情期时表达量最高。而目前对3β-HSD在初情期附睾不同区段的研究未被报道,因此本实验以香猪不同区段的附睾组织作为实验对象,通过使用免疫组织化学（IHC）与蛋白质免疫印迹（WB）分析3β-HSD在初情期香猪附睾5个区段（Ⅰ-Ⅴ区）的具体表达位置和表达量。IHC结果显示3β-HSD定位于香猪附睾的5个区段,且主要定位于附睾管上皮周围的平滑肌、管腔内附睾液及管腔微绒毛中。WB结果显示3β-HSD在Ⅳ区的表达量最高,并且显著高于Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区及Ⅴ区。此外,Ⅲ区的表达量显著高于Ⅰ区,但3β-HSD在Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅴ区的各组之间并无统计学差异。综上,本研究发现3β-HSD在初情期香猪附睾定位于附睾管管周平滑肌、管腔内附睾液及管腔微绒毛,表达量以Ⅳ区最高,并且以区段特异性表达。     

T1R1和T1R3在从江香猪附睾发育中的表达模式

为研究味觉受体第一家族亚型1（T1R1）和3（T1R3）在从江香猪附睾发育过程中的表达模式,探讨味觉受体在哺乳动物雄性生殖机能中可能发挥的作用及潜在医学价值,本试验以从江香猪附睾组织为研究对象,分析附睾发育4个关键时期：初情前（15 d）、初情时（30 d）、初情后（60 d）和性成熟期（180 d）T1R1与T1R3的差异表达。采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学（IHC）和Western blot检测两个味觉受体在不同日龄从江香猪附睾组织中转录、翻译水平的变化及其分布情况。RT-qPCR结果表明：TAS1R1与TAS1R3 mRNA在从江香猪附睾初情前（15 d）至性成熟期（180 d）表达量逐渐增加,且任意两个时期间差异极显著（P<0.01）。Western blot结果显示,T1R1/T1R3蛋白在180 d表达量最高,在15 d表达量最低,两者之间差异显著（P<0.05）,平均表达丰度依次为180 d > 30 d > 60 d > 15 d。IHC结果显示,T1R1和T1R3蛋白在各日龄组从江香猪附睾组织均有分布,其中T1R1蛋白主要在上皮细胞膜上,尤其是基细胞和窄细胞;而T1R3蛋白主要在微绒毛、环状空泡和精子呈强阳性表达。综上,本研究发现不同日龄从江香猪附睾的T1R1/T1R3表达从15 d逐渐增加,至性成熟达到峰值,这一表达变化与附睾上皮基细胞和窄细胞及微绒毛的T1R1/T1R3的差异表达有关,这些特殊的表达模式与附睾生理功能存在时间关联,故推测T1R1和T1R3参与附睾内精子成熟和储存的调节过程。     

从江香猪

从江香猪产于贵州省从江县 ,是我国稀有的优良地方微型猪种。 1 982年编入《中国猪种》第二集 ,1 993年被农业部列为二级保护畜种 ,1 999年荣获“99中国国际农业博览会名特优产品”称号 ,2 0 0 0年农业部 1 3 0号公告将其列入《国家级畜禽品种资源保护名录》。它以其体型矮小、肉质细嫩、基因纯合、纯净无污染等独特的优点而著称 ,并具有适应性好、抗病力强、饲养管理粗放等优点。它是在独特的自然生态条件和地理环境中通过当地少数民族群众特殊的饲养管理方式 ,经过长期的选种、选育而逐渐形成的优良地方微型猪种。1　自然生态概况及品种形…     

从江香猪气喘病血清学调查

为了解从江香猪气喘病(支原体)感染情况,2014年9月至2015年8月分别从江县和榕江县采集香猪血清共640份.用ELISA的方法对全部样品进行检测,结果显示,抗体阳性总数为526份,阳性率为82.19%.表明在从江县和榕江县香猪普遍存在猪支原体感染,因此,采取相应的防控措施,保证从江香猪的健康发展.     

从江香猪细小病毒血清学调查

为了解从江香猪细小病毒病感染情况,2014年9月至2015年8月分别从江县和榕江县采集香猪血清共640份.用ELISA的方法对全部样品进行检测,结果显示,抗体阳性总数为244份,阳性率为38.13%.表明在从江县和榕江县香猪存在不同程度的细小病毒病感染,因此,采取必要的防控措施,对香猪资源的保护与发展具有重要意义.     

从江香猪miR-143-3P克隆及组织表达

为探究miR-143-3P对从江香猪的表达调控作用,本研究通过SWChen 2.3程序筛选出PRKAA1基因3'-UTR相关的miRNAs,利用生物信息学软件分析其保守性,采用茎环法设计引物克隆miR-143-3P序列,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该miRNA在从江香猪各组织中的表达水平.结果表明:...     

从江香猪不同组织脂蛋白脂酶mRNA的表达及其酶活性研究

为进一步探究脂蛋白脂酶(LPL)基因的功能,揭示其对从江香猪肉质性状的影响,本研究采用荧光定量RT-PCR技术结合酶活性检测方法分析了从江香猪不同组织LPL基因表达水平及活性规律。结果显示,LPL基因在从江香猪大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大肠、背肌、子宫和卵巢10种组织内均有表达;其中,背肌和心脏组织中表达量较高,子宫和肺组织中表达量较低,且背肌中LPL mRNA表达量显著高于其他各组织(P0.05)。从江香猪4种组织LPL活性分析结果表明,背肌组织中的LPL活性显著高于子宫和心脏组织(P0.05),说明背肌中脂肪沉积能力高于子宫和心脏组织,研究结果将为今后分析该基因对从江香猪肉质性能的影响奠定基础。     

促进从江香猪生产发展的技术措施及对策

香猪是我县的特色地方品种,它以其“体型矮小,肉质细嫩,基因纯合,纯净无污染”等特点而闻名全国,自1998年以来,为了发挥香猪品种资源优势,县委、县政府结合县情实际,把发展香猪生产作为农村脱贫致富的一项支柱产业来抓,在国家、省、地县的关心和重视下,先后投入600多万元,建成面积达600m2,年屠宰50万头猪的现代化加工生产线和贮存200t的冷库一座,组建香猪开发公司,研制出腊香猪、烤香猪、香猪香肠、香猪火腿,香猪腊肉、美味心肝等系列风味食品,在香猪     

从江香猪CAST基因的组织时序表达规律分析

为探究钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因在从江香猪组织中的时序表达规律,实验采用实时荧光定量PCR技术检测1、3、6、9、12月龄从江香猪心肌、肝脏、骨骼肌、背最长肌和脂肪5个组织中CAST基因mRNA的表达情况,并采用RT-PCR方法对贵州从江香猪CAST编码区基因进行克隆.结果表明:CAST基因在不同年龄阶段从江香猪...     

从江香猪圆环病毒Ⅱ型血清学调查

为了解从江香猪圆环病毒病Ⅱ型感染情况,2014年9月至2015年8月分别采集从江县和榕江县非免疫香猪血清318份,用ELISA方法对全部样品进行检测。结果:抗体阳性率为66.04%(210/318)。表明在从江县和榕江县香猪主产区存在不同程度的圆环病毒Ⅱ型感染,且规模场的香猪感染率明显低于散养户。     

贵州从江香猪基因组中CNVR36的多态性与产仔数和体尺相关分析

为了研究拷贝数变异与香猪生长及产仔数之间的关系,采用荧光定量PCR方法,测定香猪高、低产群体基因组中CNVR36的拷贝数变化,并与柯乐猪、荣昌猪、大白猪和糯谷猪4个猪品种相比较,进而分析拷贝数变异与香猪生长及产仔数性状之间的关系。结果显示,从香猪基因组中检测到CNVR36的拷贝数存在多态性变化:高产群体中以拷贝数增加为主,低产群体中以拷贝数缺失为主,经卡方检验,两个群体间的拷贝数变异频率差异极显著(P0.01)。柯乐猪、荣昌猪、大白猪和糯谷猪4个猪品种的CNVR36拷贝数以增加为主,相关性分析结果表明,香猪CNVR36拷贝数与胸围之间存在弱的负相关关系,糯谷猪CNVR36的拷贝数与其体宽和胸围有一定的相关关系,荣昌猪的CNVR36拷贝数与体高有一定的负相关关系。推测香猪CNVR36的拷贝数变异可能与生长发育有一定的联系。     

从江香猪抑制素α基因克隆及其卵巢表达研究

为了探索抑制素α基因(inhibin-α,INHA)与从江香猪繁殖性状之间的相关性,试验采用特异性聚合酶链式反应(PCR)技术克隆从江香猪INHA基因,测定其核苷酸序列,通过等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)方法检测从江香猪低产群与高产群之间INHA基因的多态性变化,以实时荧光定量PCR技术检测高产、低产从江香猪卵巢组织中INHA基因的表达量。结果表明,从从江香猪基因组中成功克隆了INHA基因,编码区完整,全长1095 bp,编码364个氨基酸;经比对发现, INHA基因外显子2序列中存在2个候选SNPs位点(G359A和A373G)。经大样本检测,从江香猪高产群与低产群之间2个候选SNPs位点的基因频率没有明显差异;相比之下,高产从江香猪卵巢中INHA基因的表达量较高。研究结果提示,从江香猪INHA基因结构保守,可能主要通过基因的表达量变化调节从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

日粮能量对贵州从江香猪肌肉中氨基酸含量的影响

为研究日粮能量水平对贵州从江香猪肌肉中氨基酸含量的影响,在满足氨基酸蛋白质等营养水平的前提下,采取不同能量的饲料进行饲喂,选取10头年龄、体重接近的从江香猪,随机分为高能量日粮组(14.35 MJ/kg)和低能量日粮组(12.26 MJ/kg)。试验结果显示:低能量组和高能量组从江香猪肌肉中氨基酸总量分别为84.33 g/100 g和83.96 g/100 g,含量丰富。低能量组从江香猪肌肉氨基酸除甘氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸外,其余氨基酸含量都高于高能量组,差异均不显著(P0.05)。低能量组从江香猪肌肉总氨基酸含量、半必需氨基酸含量、非必需氨基酸含量和鲜味氨基酸含量均高于高能量组,差异不显著(P0.05);低能量组必需氨基酸含量低于高能量组,差异不显著(P0.05)。从江香猪肌肉中高能量组EAA/TAA值和EAA/NEAA值均高于WHO/FAO理想蛋白质标准所规定的40%和60%,表明从江香猪肌肉在氨基酸组成上十分接近WHO/FAO理想蛋白质的标准,能为人体提供较为丰富的必需氨基酸。因此,适量降低日粮中的能量水平在从江香猪断奶仔猪实际饲养中是可行的。     

从江香猪源Ⅰ、Ⅱ型干扰素生菜中融合表达及其生物活性

干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江香猪源干扰素植物表达载体PBI121-IFNα2、PBI121-IFNα2γ、PBI121-IFNγ、PBI121-Vec转入根癌农杆菌LBA4404中,用真空渗透法将携带干扰素质粒的根癌农杆菌感染生菜叶片;用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)技术分析从江香猪源干扰素蛋白活性。结果显示:GUS染色和ELISA检测证明从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中实现了表达;Q-PCR检测显示:在Marc-145细胞上从江香猪源干扰素蛋白对PRRSV的复制有明显抑制作用,在PK15细胞上从江香猪源干扰素蛋白对干扰素γ诱导蛋白30(interferon-gamma-inducible protein 30,IFI30)、2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase,OAS)、抗黏液病毒蛋白(myxovirus resistance,MX)基因的mRNA水平的上调有一定的促进作用。本研究成功实现从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中进行表达且表达蛋白具有生物学活性,为从江香猪源Ι型和Ⅱ型干扰素新复合型药物植物蛋白的开发利用提供参考依据。     

从江香猪生精上皮周期及睾丸发育的形态学分析

试验旨在探究初情期前后生精上皮周期差异及睾丸发育过程中的形态学变化。通过测定15、30、60和90 d睾丸相关指数,结合睾丸组织形态学特征,判断香猪初情期,划分从江香猪生精上皮周期。结果显示,30 d的睾丸指数较15 d极显著升高（P<0.01）,睾丸重、长轴及短轴的增长率分别为298.05%、66.42%和65.45%,60和90 d两个阶段睾丸重增长率相对稳定。形态学观察表明,从江香猪30 d时生精小管出现游离精子,完成第一次生精并进入初情期;与15 d相比,30 d生精小管面积和生精上皮厚度极显著增加（P<0.01）,增长率分别为136.12%和40.19%,在60和90 d均处于稳定增长状态。睾丸细胞数统计显示,日龄增加不影响支持细胞（setoli cells,SC）数量（P>0.05）,而30 d生殖细胞数（germ cells,GC）较15 d极显著增加（P<0.01）。相关分析结果发现,生殖细胞数量增加与生精小管面积增大、生精上皮厚度变化之间呈明显正相关（r=0.994;0.96）。根据生殖细胞组合形式差异,将初情期前后生精上皮分为3和8个阶段。初情期前生殖细胞以第一次减数分裂前期为主,A、B型精原细胞、SC、初级精母细胞（primary spermatocyte,Ps）、前细线期（preleptotene,PI）、细线期（leptotene,L）等生殖细胞在初情期前后生精上皮中均存在,而圆形精子（round spermatids,R）、延伸精子（elongating spermatid,E）、精子细胞（spermatozoa,S）仅存在于初情期后的生精上皮。本研究结果表明,从江香猪30 d初情,睾丸发育以生殖细胞和生精小管面积的迅速增加为主,该结果对从江香猪早熟性状挖掘、种猪选育及开发利用等有重要的指导意义。     

高产从江香猪资源调查及其FSH基因型分析

对贵州省从江县养殖的从江香猪资源进行了全面的调查,发现当地存在特殊的高产从江香猪群体。对同龄的高、低产香猪的体尺进行对比,同时采用PCR分析2个群体的促卵泡激素β亚基(follicle stimulating hormone,FSHβ)的基因型,结果表明,高产从江香猪群体的产仔数明显高于低产群体,同时,从江香猪高产群体的体长、体重、胸围、腰围4项指标明显较高(P<0.05),纯合的AA基因型频率也较高。结果表明:高产从江香猪不仅产仔数多,同时生长速度较快,基因更为纯合。从江香猪高产群体的深入研究将为香猪资源的多方位开发利用奠定基础。     

从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达研究

试验旨在探讨从江香猪肌内前体脂肪细胞分化过程中相关基因的表达。采集3日龄从江香猪背最长肌,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离肌内前体脂肪细胞,进行原代和传代培养,并对其进行形态学观察。诱导培养后,利用油红O染色法对其进行鉴定。采用实时荧光定量PCR方法检测细胞诱导分化0、24、48、72和144 h时脂肪相关基因丙酮酸脱氢酶激4（PDK4）、成纤维细胞生长因子10（FGF10）、脂联素（ADIPOQ）、脂肪酸合成酶（FAS）、脂蛋白脂酶（LPL）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4（FABP4）、蛋白激酶B（AKT2）的表达,选择诱导0 h作为对照组。结果显示,分离的肌内前体脂肪细胞5 h开始贴壁,贴壁的细胞呈圆形,胞体透明,经传代后,细胞形态均一,经诱导培养后,油红染色呈红色。实时荧光定量PCR结果显示,PDK4、ADIPOQ、C/EBPα、FAS、FABP4和AKT2基因mRNA表达水平在诱导48 h时均呈现较高表达,极显著高于其余各阶段（P<0.01）;FGF10基因mRNA表达水平在诱导24和48 h时均较高;LPL基因mRNA表达水平在诱导72 h时极显著高于对照组（P<0.01）,之后明显下降;PDK4、ADIPOQ和FGF10基因mRNA表达水平在诱导144 h时均极显著低于对照组（P<0.01）;C/EBPα基因mRNA表达水平在诱导144 h时显著高于对照组（P<0.05）;FAS基因mRNA表达水平在诱导144 h时显著低于对照组（P<0.05）;AKT2和LPL基因mRNA表达水平在诱导144 h时与对照组差异不显著（P>0.05）。本试验成功培养了从江香猪肌内前体脂肪细胞,并检测了不同诱导阶段脂肪相关基因的表达情况,为进一步研究从江香猪脂肪代谢和沉积提供参考依据。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta,IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%,与禽的同源性最低（35.2%）;从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。