油莎豆抗旱基因CeDREB2.1的克隆与功能分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)能够激活逆境相关基因的表达,提高作物的抗性。沙地植物油莎豆(Cyperus esculentus)具有耐旱、耐瘠等特性,在抗旱节水和生态保护过程中发挥着重要作用。本研究在前期转录组测序中发现了一个DREB转录因子,进而采用PCR扩增、序列分析、表达载体构建和非生物胁迫表达等方法,对油莎豆CeDREB2.1的功能进行初步分析。结果表明,从油莎豆中克隆的CeDREB2.1基因(登录号MZ713253),其开放阅读框为1191 bp,编码397个氨基酸;序列分析表明,CeDREB2.1具有典型的AP2/ERFBP结构域,为亲水性蛋白,α螺旋、延伸链、β折叠和无规卷曲所占比重分别为26.01%、6.57%、2.78%和64.65%;系统进化分析表明,CeDREB2.1与其他物种DREB间序列相似性较高,与胡杨、杨树和苹果的DREB蛋白亲缘关系较近;同时将CeDREB2.1连接到pCSXN上,构建了植物超表达载体并转化拟南芥,转基因拟南芥具有抵抗干旱胁迫的作用;表达分析表明,油莎豆CeDREB2.1能够被干旱、高温、低温、盐和ABA等非生物胁迫诱导表达。     

香蕉MaWRKY18的克隆及表达特征分析

为了研究WRKY基因在香蕉与Foc TR4(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)互作中作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了一个WRKY基因全长。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框,编码275个氨基酸,与香蕉A基因组预测出的(XP_009392153)成员的同源性为100%,因此将其命名为MaWRKY18。MaWRKY18与MaWRKY71(ADR71866)亲缘关系近,聚类在一个分支上。RT-PCR分析表明该基因在香蕉各器官(根、球茎、假茎、叶、花和果实)中均有表达。MaWRKY18受水杨酸和乙烯诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达。亚细胞定位表明该基因编码的蛋白定位在细胞核中,且C端具有转录激活活性。在Foc TR4接种后,MaWRKY18在感病品种中下调表达,在抗病品种中上调表达。结果表明克隆到的MaWRKY18可能在香蕉与Foc TR4互作过程中介导抗病性。     

南方根结线虫侵染下罗汉果WRKY转录因子的鉴定分析

为了确定南方根结线虫侵染早期罗汉果植株中与侵染相关的WRKY基因,以接种南方根结线虫7 d后的罗汉果侧根为材料进行转录组测序分析。基于测序序列的Nr、SwissProt注释结果,共鉴定到21个WRKY基因,其中有4个转录因子含有2个WRKY结构域,其余17个转录因子只有1个WRKY结构域。系统发育分析表明,5个WRKY转录因子为第一家族成员,2个为第三家族成员,其余14个为第二家族成员。有8个WRKY转录因子与已报道的根结线虫诱导相关WRKY转录因子同源性较高,初步推测下调表达的SgWRKY2、SgWRKY3和SgWRKY17可能与南方根结线虫的早期侵染有关,它们很可能参与了线虫取食位点与巨细胞形成的复杂调控作用。本研究将为今后阐明根结线虫与罗汉果互作的分子机制提供参考依据。     

白桦TGA基因家族全基因组鉴定及表达特性分析

TGA转录因子是bZIP转录因子(basic region-leucine zippers)家族成员，是植物中最早鉴定得到的一类转录因子，可以结合基因启动子的TGACG序列，调节靶基因的转录水平，在植物防御反应及花器官发育中发挥重要作用。本研究从白桦的基因组数据库中筛选出6条TGA基因，分别命名为BpTGA1～BpTGA6。生物信息分析结果表明：白桦TGA家族蛋白主要富含酸性氨基酸，亚细胞定位在细胞核，无信号肽结构，二级结构以α-螺旋为主，均属于亲水性蛋白，无跨膜结构。白桦TGA家族基因启动子区存在10～40个不等的增强启动元件(CAAT-box)和核心启动子元件(TATA-box),还具有非生物胁迫和逆境胁迫响应相关元件。系统进化分析结果表明：白桦TGA家族基因与拟南芥TGA家族基因亲缘关系较近。RT-qPCR结果表明，白桦TGA家族基因在根、茎、叶中的表达各有不同，BpTGA3在根中的表达量较高；BpTGA1、BpTGA2、BpTGA4和BpTGA6在茎中的表达量较高；BpTGA5在叶片中表达量较高。该家族成员中BpTGA2、BpTGA4、BpTGA5响应链格孢霉菌和立枯丝核菌侵染...     

WRKY转录因子在烟草受CMV侵染和激素处理中的表达模式初步分析

WRKY转录因子在调控植物抵抗病原菌的侵染中发挥重要作用,但是,目前为止还没有WRKY转录因子在烟草抗CMV中调控机理的研究。本研究检测了感病品种‘K326’和抗病品种‘TT8’在接种CMV后其WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达情况。结果显示,CMV侵染后‘TT8’中4个WRKY转录因子表达量均有大幅上升;而‘K326’中WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达量与CMV侵染前无显著差异,WRKY1表达量则大幅下降。幼苗经外源激素(水杨酸、茉莉素、乙烯)处理后用RT-PCR检测,结果表明,‘K326’和‘TT8’中WRKY转录因子对外源激素的诱导响应比较复杂多样,但总体表现为在‘TT8’中WRKY1、WRKY2和WRKY4会受到乙烯和茉莉酸的诱导,但在‘K326’中转录因子的表达未受明显诱导。     

黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因(allatostatin,AST)在调控黏虫Mythimna separata(Walker)保幼激素(juvenile hormone,JH)中的功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902bp,开放阅读框378bp,编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33kD,等电点为9.25,具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明,黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高,头部其次,卵巢最低;黏虫头部AST表达量在7日龄最高,飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用,明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。     

玉米弯孢叶斑病菌Clg2基因克隆、序列特征和不同发育阶段表达分析

异源三聚体G信号通路在调控植物病原真菌的形态、侵染结构形成和致病力等方面具有重要作用。本研究根据玉米弯孢叶斑病菌新月弯孢全长cDNA文库中的EST序列,克隆获得一个含1 074bp开放读码框(ORF)Gα基因。该基因包含5个外显子和4个内含子,编码357个氨基酸,被命名为Clg2。通过序列比对和进化树分析,证明Clg2蛋白具有Gα蛋白结构特征和保守序列区,与小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP)和大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)中的Gα蛋白相似性高达96%和97%,处于同一分支。采用实时荧光定量PCR技术分析了Clg2基因在病菌不同发育阶段的表达水平,显示在菌丝中表达水平最低,在分生孢子中表达量最高,暗示Clg2基因在病菌分生孢子形成期起重要作用。上述结果将为开展Clg2蛋白功能研究奠定基础。     

基于转录组测序的柴达木地区枸杞根腐病发病机理研究

为初步了解柴达木地区枸杞根腐病发病机理,文中通过转录组测序技术对健康和发病枸杞进行测序分析。结果共筛选得到6503个差异表达基因,其中3558个差异上调基因,2945个差异下调基因。通过差异基因GO功能注释分析,GJ(健康组) vs GF(发病组)中差异表达基因主要表现在代谢过程、细胞过程、催化活性、结合、细胞和细胞部分等生物学功能上。KEGG代谢通路分析显示,差异上调基因主要富集在内质网中的蛋白质加工、植物激素信号传导、植物-病原体互作等代谢通路;差异下调基因主要富集在碳代谢、氨基酸生物合成、光合作用生物的碳固定、糖酵解/糖异生、光合作用等通路上。转录因子预测结果显示：24个转录因子表达发生了变化,分别归属于13个转录因子家族,C2H2、TCP、WRKY等多个转录因子的表达均受到不同程度的抑制。利用实时荧光定量PCR技术对挑选的10个关键差异表达基因进行验证,结果显示10个差异表达基因表达趋势与转录组测序相一致。     

芜菁WRKY group Ⅲ家族鉴定及其对根肿病菌和激素的响应

WRKY转录因子是植物中特有的一类转录因子，已有研究表明WRKY groupⅢ家族众多基因在抵御生物胁迫的过程中发挥着重要的作用。为了解WRKY groupⅢ家族成员在芜菁根肿病抗性中的潜在功能，利用生物信息学分析方法，鉴定到21个候选WRKY groupⅢ家族基因，其不均匀分布于芜菁的9条染色体，编码蛋白包含258～916个不等的氨基酸残基，含0～8个不等的motif结构，大部分成员包含按顺序排列的motif 4-5-7/(8-2)-1-3。WRKY groupⅢ家族各成员启动子区域含有大量光、激素和逆境胁迫响应元件，在激素响应元件中以Me-JA最多。qRT-PCR结果显示WRKY groupⅢ家族基因可响应根肿病菌诱导，其中BrWRKY46-2、BrWRKY70-2在抗病材料根部表达量显著上调，感病材料中降低；经外源SA诱导后表达量上调，Me-JA诱导后下调，表现出相反的表达模式。亚细胞定位结果显示，BrWRKY46-2和BrWRKY70-2均定位于细胞核中。推测芜菁WRKY groupⅢ家族基因广泛参与了根肿菌响应过程，且BrWRKY46-2和BrWRKY70-2与芜菁品种抗病和...     

双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco的克隆、分子特征及表达

为了解新发现的农业害虫双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)非典型嗅觉受体Orco的分子特征与表达,通过分析转录组数据并利用RT-PCR技术克隆了双委夜蛾Orco基因,并采用实时定量PCR技术研究了该基因的组织表达谱。结果显示,双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco基因开放阅读框全长1 422 bp,编码473个氨基酸,经氨基酸结构预测具有7个跨膜区,N端在膜内,C端在膜外;该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫Orco序列相似性极高,因此将该基因命名为Adis Orco(Gen Bank登录号:KR632987),此氨基酸序列C末端第6跨膜区和第7跨膜区之间以及第7跨膜区的序列保守性最高;PCR结果显示,Adis Orco主要在成虫触角中表达,且在雄蛾触角中的表达量是雌蛾触角中的4.2倍,在足、翅、下唇须和喙等组织中也有少量表达。     

棉铃虫载脂蛋白受体基因克隆及转录分析

载脂蛋白受体(lipophorin receptor, LpR)在昆虫体内脂质转运中发挥重要作用。为了明确棉铃虫载脂蛋白受体基因在其卵巢发育及饥饿胁迫中的功能, 本研究克隆了棉铃虫 HaLpR 基因的cDNA序列(GenBank登录号KU355886.1), 全长3 117 bp, 开放阅读框为2 643 bp, 编码880个氨基酸; 其氨基酸序列包含典型的低密度脂蛋白受体结构域, 与其他鳞翅目昆虫的LpR相似度>80%。荧光定量PCR检测结果显示, HaLpR 在雌蛾的卵巢和脂肪体组织中相对转录水平最高; 在雌蛾卵子发生期均有转录, 在雌蛾羽化后3 d表达量达到最高峰; 饥饿处理会抑制 HaLpR 在雌蛾卵巢和脂肪体中的转录。研究结果有助于解析HaLpR参与棉铃虫卵巢发育过程中的脂质转运以及应对饥饿胁迫的作用。     

本氏烟NbWRKY40亚家族转录因子抗病相关功能研究

 植物WRKY类转录因子的IIa亚类广泛参与调控植物的生物胁迫和非生物胁迫过程。本研究根据拟南芥和普通烟中具有抗病和抗胁迫功能的IIa亚类WRKY40转录因子的序列,利用基因同源克隆法,获得本氏烟中NbWRKY40基因。序列分析表明在本氏烟中有5个属于IIa亚类的基因,其序列之间具有高度相似性。qRT-PCR检测发现NbWRKY40基因是受寄生疫霉侵染诱导上调表达的基因,通过VIGS技术研究该类基因在本氏烟中的抗病相关功能,用半活体营养型寄生疫霉进行抗病性试验,结果表明NbWRKY40基因的沉默降低了本氏烟对寄生疫霉的抗性,且在侵染点的细胞坏死程度增强,过氧化氢积累和胼胝质沉积都明显减少。NbWRKY40基因沉默同样降低了本氏烟对死体营养型灰霉菌的抗性。检测NbWRKY40基因沉默后4个不同抗病信号通路下游基因的表达,发现基因沉默导致参与抗病和SA途径的PR1b、PR2b基因受疫霉侵染诱导表达的水平明显下降。综上,推测NbWRKY40基因可能依靠SA介导的信号通路参与调控本氏烟抗病性。     

8个WRKY转录因子在水稻叶片生长和抗病过程中的表达分析

 WRKY是植物体内最大的转录因子家族之一, 其成员在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为了解水稻WRKY的功能, 本研究利用蛋白质免疫印迹(western blotting, WB)技术, 检测了8个WRKY转录因子在水稻叶片生长和Xa21介导的抗白叶枯病过程中的表达丰度变化。结果表明:OsWRKY12、43、55和86在苗期表达量较低, 随叶片的生长表达逐步增加;OsWRKY50和84在苗期叶片中的表达量相对较高, 成熟期下降;未检测到OsWRKY40/64和52在叶片中的表达。在Xa21介导的白叶枯病抗性反应中, OsWRKY40/64、50和52受白叶枯病菌诱导表达, OsWRKY84受侵染后表达量上调, OsWRKY12、43、55和86在抗病过程中没有检测到表达丰度的变化。进一步比较这些转录因子在抗、感和对照(Mock)反应中的表达, 发现抗、感反应间蛋白质的表达变化是相似的。研究结果提示:OsWRKY12、43、55和86可能在叶片正常生长中发挥作用;OsWRKY40/64和52可能在水稻-白叶枯病菌互作过程中发挥作用;OsWRKY50和84则在叶片生长和抗白叶枯病过程中都有一定的功能。     

茶尺蠖脂肪酶合成基因EoL2的克隆和组织表达特征

昆虫脂肪酶可参与脂类消化、吸收和运输,并能介导植物的抗病虫功能。本研究通过茶尺蠖唾液腺转录组数据库发掘到该基因片段,采用RACE技术克隆获得了一条茶尺蠖脂肪酶合成基因序列,命名为Eo L2,并检测了其在茶尺蠖不同生育期及不同组织部位中的相对表达水平。研究结果表明,Eo L2的c DNA序列全长1310 bp,开放阅读框为1041 bp,编码一个包含346个氨基酸的蛋白,推测该蛋白相对分子量为37.96 k D,推测等电点(PI)为8.41,具有脂肪酶典型的GXSXG丝氨酸活性保守序列,其氨基酸序列与家蚕相似度最高,为57%。实时荧光定量PCR结果表明,Eo L2在卵中的表达量显著低于其它虫态;在1龄幼虫期的相对表达水平显著高于2~5龄;在成虫中的表达量显著高于蛹;在血淋巴中的表达量显著高于中肠、表皮、脂肪体和唾液腺。     

一个水稻新的NAC转录因子OsNAC3功能的初步研究

OsNAC3是水稻NAC转录因子家族的一个成员,受MeJA、干旱、盐及冷胁迫诱导表达。OsNAC3与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白定位在烟草细胞核中。OsNAC3在酵母中具有转录激活活性,且转录激活域位于其C端;酵母双杂交和pull down证实OsNAC3可以形成同源二聚体。采用凝胶阻滞的分析方法,明确OsNAC3在体外能与NAC识别序列NACRS特异结合。研究结果为进一步揭示OsNAC3的生物学功能打下了基础。     

谷子DREB转录因子基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达模式分析

为了挖掘谷子的抗旱基因,根据小麦转录因子基因TaDREB6的序列设计引物,从谷子中分离到一个DREB基因的cDNA序列,长1113 bp,编码259个氨基酸,具有DREB类转录因子典型的N-末端碱性核定位信号和高度保守的AP2/ERFBP结构域.植物DREB类氨基酸序列多重比较分析表明,谷子DREB基因属于DREB2类...     

甘肃省红豆草病原真菌鉴定及病害发生动态调查

为明确甘肃省红豆草的病害种类、发生动态和危害状况,采用病原物分离与培养、形态学及分子生物学鉴定和致病性测定确定红豆草病害种类,于2012—2013年在通渭、渭源、榆中和碌曲4县调查各病害的发病率以确定发生动态,观察病害田间发生特点并结合调查数据评价其重要性。结果表明,4县共发生真菌性病害12种,分别为大茎点霉叶斑病(病原为大茎点霉属真菌Macrophoma sp.)、壳针孢叶斑病(病原为歪头菜壳针孢Septoria orobina)、炭疽病(病原为白蜡树刺盘孢Colletotrichum spaethianum)、黑秆病(病原为红豆草壳二孢Ascochyta onobrychis、菠菜刺盘孢C.spinaciae和链格孢Alternaria alternata混合侵染)、壳二孢叶斑病、茎点霉叶斑病、尾孢叶斑病、柱格孢白斑病、匍柄霉叶斑病、链格孢黑斑病、锈病和白粉病,其中大茎点霉属真菌、白蜡树刺盘孢和菠菜刺盘孢在红豆草上首次发现;尾孢叶斑病和壳针孢叶斑病为甘肃新记录病害;大茎点霉叶斑病为世界新病害,仅于碌曲县发现。白粉病、锈病、链格孢黑斑病发生于红豆草生长后期,其它病害则始于6月;6—9月危害加重的为黑秆病和柱格孢白斑病,发病率最高达89.7%和96.0%;危害渐轻的为茎点霉叶斑病、壳二孢叶斑病和壳针孢叶斑病,发病率最高达88.7%、57.4%和45.1%。黑秆病和茎点霉叶斑病在甘肃省目前危害最重。     

球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因分析

本文研究球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因,为提高球孢白僵菌的致病力提供基因靶点,从而提高球孢白僵菌对小菜蛾的防治效果。通过室内生物测定,筛选出球孢白僵菌对小菜蛾的高毒力菌株;采用新一代Solexa高通量测序技术对纯培养的球孢白僵菌和球孢白僵菌侵染小菜蛾48 h的虫菌混合样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学方法分析差异表达基因涉及的基因功能及细胞通路等;应用荧光定量PCR技术验证20个基因的差异表达。转录组测序结果显示,纯培养的球孢白僵菌与侵染小菜蛾幼虫48 h的球孢白僵菌转录组对比分析共得到8383个差异表达基因,其中显著差异表达基因716个,上调基因350个,下调基因366个。本研究筛选获得的差异表达基因,特别是上调表达的基因可能与球孢白僵菌对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类表明,DEGs被注释到26个GO term中,包括11个生物学过程,8个细胞组分和7个分子功能;Pathway分析表明共有12个Pathway,93个上调基因和61个下调基因参与了这些途径。深入分析发现,胞外丝氨酸富集蛋白、细胞壁蛋白、胞外双加氧酶、铁转运蛋白、细胞壁半乳糖抗原蛋白等在侵染过程中与毒力相关的基因均具有显著性差异表达。研究结果为阐明球孢白僵菌对小菜蛾的侵染机制提供了基础。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。