1,25-( OH)2D3及LPS对2型糖尿病肾病尿毒症患者单核细胞维生素D受体表达的影响

目的 探讨1,25-(OH)2D3及TLR4配体(脂多糖,LPS)对2型糖尿病(T2DM)和糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)尿毒症患者血清干预的单核细胞维生素D受体(VDR)表达的影响,进一步探索1,25-( OH)2D3在T2DM和DN炎症性免疫反应中的作用.方法 分离研究对象(健康对照组、T2DM组和DN尿毒症组)外周血血清,孵育THP-1单核细胞,然后于含或不含10-7 mol/L的1,25-(OH)2D3培养液中培养48 h后,再用终浓度为1μg/ml的LPS干预24h,收集单核细胞和培养上清.采用RT-PCR检测VDR mRNA表达,Western blot、免疫荧光检测THP-1单核细胞内VDR蛋白表达.ELISA法检测细胞培养上清IL-6和IL-10浓度.结果 与正常对照组比较,在LPS的刺激下T2DM组和DN尿毒症组THP-1单核细胞内VDR mRNA水平下调[对照组(0.99±0.25);T2DM组(0.65±0.24);DN尿毒症组(0.62±0.27),P＜0.05];DN尿毒症组THP-1单核细胞内VDR蛋白表达比正常对照组和T2DM组显著下调[对照组(0.48 ±0.05);T2DM组(0.50±0.06);DN尿毒症组(0.20±0.01),P＜0.01],且LPS增强以上患者血清孵育的THP-1单核细胞炎症细胞因子IL-6的分泌[对照组(15.13±1.61);T2DM组(24.06 ±2.92);DN尿毒症组(70.77 ±5.48),P＜0.05];而1,25-(OH)2D3可部分阻断上述作用.结论 LPS能下调T2DM和DN尿毒症患者单核细胞VDR mRNA和蛋白的表达,引起促炎和抗炎细胞因子失调.1,25-(OH)2D3可部分逆转LPS的作用,对T2DM和DN尿毒症可能具有一定的保护作用.     

1,25-(OH)_2-D_3对抗菌肽表达调控的影响

通过外源途径调控机体内源性抗菌肽表达,以增强动物的防御能力和提高动物的生产性能是实现"健康养殖"的一条新型途径。生物体受病原微生物入侵后可由TLR介导内源性抗菌肽表达。结果表明:由PAMP诱发抗菌肽合成机制的模式有TLR-NF-κB和TLR-VDR 2大信号传导通路。TLR-VDR通路的基本过程是激活相应TLR→诱导Cyp27B1表达→产生1,25-(OH)2-D3→激活VDR→识别抗菌肽基因VDRE序列而调节抗菌肽表达。1,25-(OH)2-D3作为TLR-VDR通路的重要调节物质,可诱导抗菌肽在许多细胞中表达并与其他物质对抗菌肽表达起协同作用。     

25-OH-D3及1,25-（OH）2-D3的研究进展

25-OH-D3及1,25-（OH）2-D3是维生素D的真正活性形式,本文对25-OH-D3及1,25-（OH）2-D3的生物学功能、吸收代谢特点和影响因素进行了综述,为为其应用提供理论参考。     

1,25(OH)_2D_3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的影响

为了研究1,25(OH)2D3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的作用,从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)分离骨髓细胞进行培养,在培养过程中分别添加10-7,10-8和10-9mol/L的1,25(OH)2D3。通过倒置显微镜观察其活体形态,对培养1,3,5,7 d的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鉴定,培养7 d后进行骨吸收陷窝和功能分析。结果显示,10-8mol/L组除第1天和其他各组差异不显著以外,第3,5,7天诱导所生成的破骨细胞的数量都显著高于10-7和10-9mol/L这2组(P0.05),极显著高于对照组(P0.01)。经扫描电镜观察,无论是吸收陷窝面积还是陷窝吸收程度,10-8mol/L组均显著高于其2组;对照组无明显陷窝。由此可知,1,25(OH)2D3能诱导鸡胚骨髓细胞形成破骨细胞,且浓度为10-8mol/L时效果最好,所诱导的破骨细胞活性较高。     

1,25(OH)2D3通过调节氧化还原状态影响猪前体脂肪细胞分化

维生素D可影响动物脂肪形成,然而其对脂肪细胞分化的作用仍有争议。本研究分离培养3日龄仔猪皮下前体脂肪细胞,成脂诱导后,分别以0 nmol/L(对照)、0.1 nmol/L和100 nmol/L1,25(OH)₂D₃处理,通过分析其对细胞分化、氧化还原指标及基因表达的影响,探讨维生素D调控猪脂肪细胞分化的机制。结果表明,0.1 nmol/L 1,25(OH)₂D₃显著抑制猪前体脂肪细胞分化(P<0.05),极显著提高细胞ROS和GSSG水平(P<0.01),降低GSH及GSH/GSSG比值(P<0.01);100 nmol/L 1,25(OH)₂D₃显著促进细胞分化(P<0.05),降低ROS和GSSG水平(P<0.01),提高GSH及GSH/GSSG比值(P<0.01)。此外,100 nmol/L 1,25(OH)₂D₃显著上调SOD2和Prx3 mRNA表达,但0.1 nmo...     

孕酮对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2表达的影响

研究孕酮(P4)对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素2(SBD2)基因表达的影响,探讨P4调节SBD2表达的潜在机制。建立绵羊输卵管上皮细胞体外培养体系,用不同浓度(10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L)P4分别处理绵羊输卵管上皮细胞0、2、6、12、24、48h,筛选P4诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD2mRNA表达的最佳条件。然后使用10-6mol/L孕激素核受体拮抗剂RU486,50μmol/L蛋白激酶C(PKC)信号通路阻断剂H7预处理细胞1h,再使用P4诱导SBD2mRNA表达的最佳条件处理细胞,同时设只添加阻断剂(RU486和H7)处理组、只添加孕酮(P4)处理组和空白对照组,通过RT-qPCR技术检测SBD2mRNA的表达变化。10-9mol/LP4诱导绵羊输卵管上皮细胞6h和24h时SBD2mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),且与P4组相比,添加RU486和H7后显著抑制了P4诱导的SBD2mRNA的表达水平(P<0.01)。P4以浓度和时间依赖性方式显著增加SBD2mRNA表达,并且诱导可能通过孕酮核受体(PR)介导的基因组途径以及PKC信号通路来提高绵羊输卵管上皮的先天免疫防御能力。     

丁酸钠与VD3对IPEC-J2细胞β-防御素3 mRNA表达的协同作用

研究旨在验证丁酸钠与维生素D3 (VD3)联合使用对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)β-防御素-3(pBD3) mRNA表达的协同作用.试验分别设置丁酸钠组、VD3组、丁酸钠与VD3联合使用组.使用荧光定量PCR检测各试验组对猪小肠上皮细胞pBD3基因表达水平的影响.结果 表明,不同浓度丁酸钠均能上调β-防御素-3 m...     

1,25(OH)2D3以双向方式影响猪前体脂肪细胞增殖分化的研究

1,25（OH）₂D₃是维生素D的主要活性形式,影响人和动物脂肪形成,为探究其在猪脂肪细胞增殖分化中的作用,试验从3~5日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养前体脂肪细胞,并以浓度为0、0.1、1、10、100和1 000 nmol/L的1,25（OH）₂D₃分别处理,在培养的0、1、2、4、6、8和10 d采用MTT比色法检测细胞增殖活性;在诱导分化后0、1、2、4、6、8和10 d,以油红O染色提取法和实时荧光定量PCR检测细胞成脂分化及分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和脂肪酸合成酶（FAS）表达。结果显示,0.1和1 nmol/L 1,25（OH）₂D₃显著促进猪前体脂肪细胞增殖（P<0.05）,而浓度为10~100 nmol/L时则抑制细胞增殖（P<0.05）;0.1和1 nmol/L 1,25（OH）₂D₃显著抑制猪前体脂肪细胞分化（P<0.05）,降低PPARγ和FAS mRNA表达水平（P<0.05）,但在浓度为10和100 nmol/L时,显著促进猪前体脂肪细胞分化（P<0.05）,上调PPARγ和FAS mRNA表达（P<0.05）;浓度达1 000 nmol/L时,可能对细胞有毒性作用。综合以上结果,低浓度1,25（OH）₂D₃促进猪前体脂肪细胞增殖,而通过下调PPARγ表达抑制分化;高浓度1,25（OH）₂D₃抑制猪前体脂肪细胞增殖,通过上调PPARγ表达促进分化。1,25（OH）₂D₃对猪前体脂肪细胞增殖和分化具有双向作用。     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

β防御素124沉默通过p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

旨在研究山羊β防御素124（goat beta-defensin 124,gBD124）沉默对p38MAPK/AP1通路及下游细胞趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将设计的3条gBD124-shRNAs载入LV10-U6/RFP&Puro质粒载体,与包装质粒共转染到293T细胞中,用梯度稀释法测定病毒原液的滴度;将构建的3个LV10-gBD124和LV10-gBD124-NC载体转染到山羊附睾头细胞中,筛选有效沉默载体;然后用有效沉默载体联合转染附睾头细胞,设置了空白细胞对照组、LV10-NC组、有效沉默载体组,用2 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测gBD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子及趋化因子基因及蛋白表达情况。本研究构建了gBD124沉默慢病毒载体,筛选出LV10-gBD124-51和LV10-gBD124-161两个有效载体,并成功构建了gBD124沉默稳定转染的附睾头细胞株。与NC对照组相比,gBD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1以及AP1的两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,显著增加了RASA1基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及磷酸化p38MAPK和c-JUN蛋白表达（P<0.05）;gBD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;gBD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,gBD124沉默显著增加了培养液中IL-1β和IL-8浓度,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。     

山羊子宫感染大肠杆菌后TLR4、β防御素2和细胞因子mRNA表达变化

12只产后25 d健康奶山羊随机分为2组,即试验组和对照组.试验组将大肠杆菌O46经子宫角插管注入山羊子宫腔内制作山羊子宫内膜炎病例模型,对照组向子宫腔内注入等量的生理盐水.分别于注菌前(0 h),注菌后3,6,12,24,72,120,168 h进行临床检查、细胞学检查和子宫内膜活检采样.子宫内膜组织分为2份,一份用于制作组织学切片,另一份用于提取RNA,用荧光定量PCR的方法检测TLR4、细胞因子和β-defensin 2 mRNA表达的变化.结果显示,试验组山羊在注菌后呈明显的炎症反应,体温升高,呼吸急促,白细胞增多,阴道流出脓性分泌物;％PMN极显著升高(P＜0.001);组织学显示大量的炎性细胞浸润于子宫内膜组织;TLR4、细胞因子和β-defensin 2 mRNA表达显著升高.对照组山羊未有明显的炎症反应症状.     

鸡β-防御素-2(Gal-2)基因在大肠杆菌中的融合表达与纯化

本试验通过优化基因工程菌pMAL-c2X-Gal-2-TB1的表达条件,找到使融合蛋白表达量达到最大的最佳表达条件,后采用Amylose树脂预装柱对可溶性目的蛋白分离、纯化和Fac-tor Xa因子酶切,为了得到Gal-2,再次过柱纯化,每一步产物用SDS-PAGE方法检测.结果融合蛋白的分子量约为50KD,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的36%;纯化后的融合蛋白纯度达90%以上,且经再次纯化得到纯度较高的Gal-2.     

山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。     

17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2(SBD-2)表达的影响

[目的]探讨17β-雌二醇(E2)对体外培养的绵羊输卵管上皮细胞内抗菌肽SBD-2基因表达的影响。[方法]根据E2添加剂量设10-6mol/L组、10-7mol/L组、10-8mol/L组、10-9mol/L组和10-10mol/L组,各组细胞于加药后2、6、12、24及48 h,分别采用real-time RT-PCR技术检测E2对绵羊输卵管上皮细胞内SBD-2 m RNA表达量的影响,同时设相应的对照组。[结果]以剂量为10-8mol/L的E2处理输卵管上皮细胞6 h后,其SBD-2的表达量达到极值,极显著高于对照组(P0.01),以剂量为10-10mol/L的E2处理输卵管上皮细胞24 h和48 h后,也能显著促进SBD-2的表达(P0.01,P0.05),之后随着各时间段E2剂量的增加,SBD-2 m RNA的表达量呈逐渐降低趋势。[结论]一定剂量的E2能够在处理细胞后的特定时间促进绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 m RNA的表达,E2对输卵管上皮细胞SBD-2 m RNA表达的调节作用存在时间效应与剂量依赖关系。     

枯草芽孢杆菌细胞壁对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheep β-defesin-1,SBD-1)的表达产生影响,先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并成功收集其细胞壁,将不同浓度(0、25、50、100、2...     

山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因的克隆及酵母表达载体的构建

为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal -2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal -2基因序列设计引物,采用RT - PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal -2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β -防御素Gal -2...     

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示：(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆...     

17-β-雌二醇对培养的绵羊输卵管上皮细胞β-防御素(sBD-1)mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,根据体内雌激素浓度确定17-β-雌二醇添加的浓度分别为10-8、10-9、10-10、10-11mol/L,提取细胞总RNA,利用实时荧光定量RT-PCR测定sBD-1-mRNA的相对表达量.结果显示:一定浓度范围内(10-8、10-9、10-10mol/L),17-β-雌二醇对培养的输卵管上皮细胞sBD-1-mRNA的表达有促进作用,且呈正相关.结果表明:雌性生理周期下,雌性生殖道sBD-1-mRNA的表达与雌激素相关.     

污水施用方式及双氰胺对土壤NH3和N2O排放的影响

为了研究污水施用对环境的影响,试验探讨了污水的不同施用方式和添加双氰胺(DCD)对土壤NH3和N2O排放量的影响。结果表明:施用污水后,NH3排放量呈逐渐减少的趋势,而N2O排放量呈先升高再降低的趋势,表面施用污水的土壤NH3和N2O累计排放量最高;而添加DCD对土壤NH3和N2O排放量无显著影响(P>0.05);深层施用污水的土壤NH3和N2O累计排放量最低,分别为21.97,2.49 kg/hm2(以氮计)。说明深层施用污水可以减少土壤NH3和N2O排放量。     

重组鸭β-防御素-2制剂对樱桃谷肉鸭免疫性能及肠道绒毛的影响

试验旨在研究重组鸭β-防御素-2制剂对肉鸭免疫性能与肠道绒毛的影响。将1 000只11日龄肉鸭随机分成5个处理组,每处理组4个重复,每重复50只肉鸭。A组为对照组,饲喂基础饲粮;B组在基础饲粮中添加500 g/t杆菌肽锌;C、D和E组分别在基础饲粮中添加300、450和600 g/t的重组鸭β-防御素-2制剂。试验结果表明:胸腺指数,E组显著高于A、B和C组(P<0.05);A和D组均显著高于B和C组(P<0.05);其余各组差异不显著(P>0.05)。脾指数各组间均无显著性差异(P>0.05)。法氏囊指数,除E组显著高于A组外(P<0.05),其余各组无显著性差异(P>0.05)。随重组鸭β-防御素-2制剂添加量的增加,胸腺指数、脾指数及法氏囊指数均有增加的趋势。禽流感疫苗抗体效价E组显著高于A和B组(P<0.05),其余各组均无显著性差异(P>0.05)。随重组鸭β-防御素-2制剂添加量的增加,禽流感抗体效价也有增加的趋势。十二指肠绒毛高度,C和D组均显著高于A和B组(P<0.05)。空肠绒毛高度,A组显著高于B、C、D和E组(P<0.05)。十二指肠与空肠隐窝深度均无显著性差异(P>0.05)。试验结果表明:重组鸭β-防御素-2制剂能提高肉鸭的免疫性能与肠道绒毛的高度。