骨骼肌卫星细胞的分离和培养

骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性干细胞,负责骨骼肌的生长和骨骼肌的损伤修复。本文对分离和体外骨骼肌降临细胞的方法进行了综述,展望卫星细胞分离和培养方法的改进及应用前景。用适当的方法将卫星细胞从骨骼肌中分离出来进行体外培养,不仅能直接观察其增殖分化的特性,而且可以在排除体内其它类型细胞影响的条件下,对卫星细胞的生理和生化特点进行研究。     

多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及成肌诱导分化

为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞（satellite cells,SCs）,并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs。利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化。通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）的免疫荧光,检测肌管的形成情况。通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成。本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法的建立

为了给牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法及进一步揭示肌肉分化的机理及转基因肉牛的研究提供重要帮助,试验以新生胎牛的骨骼肌为试验材料,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ与胰蛋白酶结合对其进行消化,并通过差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行分离纯化,同时采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western-blot法对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果表明:研究成功获得了大量的牛骨骼肌卫星细胞;该细胞的标志性分子的mRNA及其蛋白表达的纯度在98%以上;细胞生长状态良好,可稳定传至90代并保持旺盛的增殖活力;细胞分化效率高,2%的马血清能够诱导细胞分化使其融合形成多核肌管,数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管,并可观察到其具有收缩现象。     

绵羊骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定与成肌诱导分化

试验旨在分离绵羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,SMSCs）,建立绵羊SMSCs体外分离、培养及鉴定体系,为后续研究提供种子细胞。以新生健康绵羊为试验动物,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化SMSCs。用RT-PCR和免疫荧光法鉴定SMSCs标记基因配对盒基因7（paired box 7,Pax7）、结蛋白（Desmin）和生肌调节因子1（myogenic regulatory factors 1,MyoD1）的表达情况;用血清撤离法诱导SMSCs向成肌细胞方向分化,成肌诱导后观察肌管的形成,免疫荧光法检测成肌分化特异性标志肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）的表达。RT-PCR结果显示,扩增条带与预期相符,所分离细胞表达SMSCs标记基因Pax7、Desmin和MyoD1;免疫荧光鉴定结果显示,所分离细胞表达SMSCs标记蛋白Pax7、Desmin和MyoD1;成肌诱导后镜下可见细胞相互融合形成多核的肌管,并表达成肌特异性标志MHC。本试验分离了绵羊SMSCs,建立了适用于绵羊SMSCs的体外培养体系,并成功进行了成肌诱导分化,为今后研究绵羊骨骼肌生长发育机制提供了试验材料和技术支撑。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化

为了在体外研究西门塔尔牛的肌肉生长发育过程并建立牛骨骼肌卫星细胞的原代细胞模型。本研究采用0.2%的Ⅱ型胶原酶消化后再使用0.25%胰酶消化获得牛骨骼肌卫星细胞（bovine skeletal satellite cell,BSSC）,并利用差速贴壁法分离获得纯化后的BSSC,使用RT-PCR、免疫荧光染色和Western blotting等方法鉴定BSSC,使用成脂诱导剂诱导其分化为脂肪细胞,油红O染色鉴定分化后细胞的成脂能力,使用2%马血清诱导其分化为肌细胞,RT-PCR鉴定静止期PAX7基因和肌细胞的标记基因MyoG在诱导前后表达量的变化。结果发现,分离纯化得到的BSSC呈梭形或纺锤形,细胞形态饱满,折光性强,随着培养时间的延长,细胞由原来的无序生长变为有序生长;RT-PCR检测发现,BSSC表面标志基因Desmin、c-Met、Myf5和特异性标志基因PAX7均呈阳性表达;免疫荧光染色及Western blotting结果显示,PAX7和MyoD基因均呈阳性表达;成脂细胞诱导分化后被油红O大量染色并观察到大量脂滴出现;成肌细胞诱导分化后静止时期PAX7基因表达量诱导前高于诱导分化后,而成肌标记基因MyoG表达量诱导前低于诱导分化后。综上,本研究成功分离获得BSSC,并证明BSSC具有分化成脂肪细胞和肌细胞的能力,为体外研究西门塔尔牛肉制品调控机制提供原代细胞模型。     

鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定

旨在建立鸡骨骼肌卫星细胞（muscle satellite cell,MSC）体外分离、培养、纯化、诱导分化及鉴定的方法。选取12胚龄SPF鸡胚,综合松散肌肉纤维和游离纤维基质层细胞等原理,对分离细胞使用的酶以及后续的细胞纯化、诱导分化方法进行优化;并从形态学、细胞分化能力、生长曲线、免疫荧光、RT-PCR等方面对MSC进行鉴定,从而提出一种鸡骨骼肌卫星细胞的混合酶消化分离培养方法。结果表明,刚分离纯化后的细胞折光性强,24 h贴壁展开后呈纺锤状;待诱导分化后能形成排列整齐的多核肌管;CCK-8测定细胞生长曲线呈典型的“S”型;优化后,细胞存活率为（90.82±1.294）%,细胞纯度为（90.44±1.264）%;免疫荧光检测标志性基因Pax7、Desmin表达阳性;RT-PCR检测标志性基因Pax7、MyHC、MyoD1呈阳性;并且分化前标志性基因Pax7表达量是分化后的1.705倍,分化后期标志性基因MyHC表达量是分化前的13.073倍。该试验建立了一种快速简便的鸡骨骼肌卫星细胞的体外培养方法,为研究鸡骨骼肌细胞生物学机制、肉鸡品种优化、细胞移植修复提供良好的细胞模型。     

猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

猪骨骼肌是动物机体重要的运动组织及人类主要的肉食来源,也是研究肌肉生长发育和疾病的良好模型。猪出生后,骨骼肌的生长发育、损伤修复都需要肌卫星细胞的参与,体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞是深入研究骨骼肌生长发育及疾病发生机理的基础,是在细胞水平进行分子功能验证的前提。随着肌肉发育和病理分子机制研究的不断深入,猪骨骼肌卫星细胞的体外分离培养技术也迅速发展起来。背最长肌、后腿肌和半腱肌常用于分离骨骼肌卫星细胞,1日龄猪背最长肌的分离效果最好。常用于分离骨骼肌卫星细胞的酶包括链酶蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等,各酶及酶联合消化的时间不同,最优的过滤方式是200目+400目联合过滤,3次离心法可获得纯度较高的细胞。常使用的培养基为DMEM/F12+10%胎牛血清(FBS)+1%青-链霉素(P/S)。骨骼肌肌卫星细胞常见标记物有配对盒基因3(PAX3)、PAX7、生肌决定因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)等。作者通过对猪骨骼肌肌卫星细胞的分离、培养及鉴定等方面进行综述,梳理出各步骤中最佳参数,为建立规范猪骨骼肌卫星细胞分离程序提供参考,以期为肌肉发育和疾病研究提供理论及技术支持。     

水牛骨骼肌卫星细胞的分离培养和生物学特性分析

为了给骨骼肌修复和心肌治疗方面的机制研究提供平台,试验以水牛胎儿为材料建立了一种简便高效的水牛骨骼肌卫星细胞体外分离和培养方法,采用机械和酶消化相结合的方法获取水牛骨骼肌卫星细胞,进行体外培养和形态观察.结果表明:体外成功分离培养出水牛骨骼肌卫星细胞;细胞在生长培养液中形态良好、生长稳定、增长快速并能进一步分化形成肌管.结果说明水牛骨骼肌卫星细胞能够在体外进行增殖和分化并保持其生物学特性.     

猪lncRNA TCONS_00791383对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织（心、脾、肺、肾、背肌和腿肌）以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平;通过设计反义核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低,检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化;通过trans （co-expression）对TCONS_00791383进行靶基因预测,使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示,TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高,在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中,TCONS_00791383的表达量逐渐上升,且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后,与对照组相比,在分化24 h,增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低（P<0.05,P<0.01）,分化标志基因MyoG表达量极显著降低（P<0.01）,在分化48 h,增殖标志基因Pax3表达量极显著降低（P<0.01）,Pax7表达量显著降低（P<0.05）,分化标志基因MyHC表达量显著降低（P<0.05）。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明,lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。     

蛋鸡骨骼肌卫星细胞分离培养及鉴定

采用组织块分离法从蛋鸡鸡胚腿部肌肉组织中体外培养获取鸡骨骼肌卫星细胞,对培养的细胞进行了传代、冻存和复苏研究,同时从分子表达水平对分离培养的卫星细胞进行了鉴定,建立了一套鸡骨骼肌卫星细胞分离、传代、冻存和复苏的方法。特异基因表达鉴定结果表明,该方法分离得到的细胞能够表达卫星细胞特异的标志基因Pax7,而肌细胞分化基因MyoD、Myogenin未表达,说明获得的肌卫星细胞纯度较高,尚未进行肌细胞的分化。     

新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础.     

LiCl激活经典Wnt信号通路诱导猪骨骼肌卫星细胞向慢肌分化

Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的增殖及分化,决定细胞的命运。LiCl通过抑制GSK-3β(glycogen synthetase kinase-3β)稳定细胞内β-catenin的表达。为研究Wnt/β-catenin信号通路在哺乳动物骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的作用。以原代培养猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,将其培养在含有1%CEE和20%胎牛血清的GMEM培养液中,再用15 mmol/L LiCl诱导分化,并采用免疫荧光染色和Western blotting等方法检测经典Wnt信号通路中相关因子及成肌分化过程中细胞的蛋白表达。结果表明:LiCl处理猪骨骼肌卫星细胞后促进分化,p-GSK-3β、β-catenin、myosin及慢肌蛋白增加,p-β-catenin、GSK-3β及快肌蛋白减少,并且核内源性β-catenin增多。结果提示,激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨骼肌卫星细胞成肌分化,并且诱导其向慢肌分化。     

哈萨克羊骨骼肌卫星细胞的分离培养及鉴定

为了建立可稳定传代的哈萨克羊骨骼肌卫星细胞培养体系,以90日龄的哈萨克羊胎羊后腿肌为试验材料,采用酶消化法(胶原酶与胰蛋白酶)对绵羊骨骼肌卫星细胞进行分离,差速贴壁法对细胞纯化;对得到的骨骼肌卫星细胞进行形态学鉴定;使用Pax7特异性标志蛋白进行免疫荧光鉴定。经过免疫荧光染色的Pax7基因的免疫阳性产物,呈明显的绿荧光,分布于细胞质中。本研究成功从哈萨克胎羊中分离出了具有良好增殖分化能力且便于传代的骨骼肌卫星细胞,为研究调控哈萨克羊肌肉生长发育的分子机制,为完善哈萨克羊肉品质的研究提供基础。     

猪骨骼肌卫星细胞中miR-24功能的初步研究及靶基因分析

为了探讨miR-24对猪骨骼肌发育的影响,对体外培养1日龄纯种长白公猪骨骼肌卫星细胞分别转染miR-24过表达载体和干扰片段,发现过表达miR-24后,成肌分化基因MyoD、Myogenin和Myf5表达量显著升高,骨骼肌卫星细胞分化趋势增强;干扰miR-24后,Myogenin的表达量显著降低;同时,靶基因预测结果显示Myogenin可能是miR-24的靶基因。     

MMP14调控骨骼肌卫星细胞分化的分子机制研究

旨在分析基质金属蛋白酶14(MMP14)调控骨骼肌卫星细胞分化的分子机制。本试验取10只4周龄C57/BL6雌性小鼠,利用胶原酶消化法分离骨骼肌卫星细胞。首先,对骨骼肌卫星细胞进行诱导分化,利用qRT-PCR和Western blot试验分析MMP14在骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期表达量的变化。应用siRNA抑制MMP14蛋白表达,分为试验组(si-MMP14)和对照组(si-NC),每组3个重复：首先诱导细胞分化,应用免疫荧光和qRT-PCR分析试验组和对照组细胞分化水平的差异;随后取增殖期细胞进行蛋白组学测序,结合生物信息学分析鉴定差异蛋白,并筛选MMP14调控的关键差异蛋白和通路。本研究结果表明：1)MMP14在卫星细胞增殖期表达上调,在分化期表达下调;抑制MMP14蛋白会抑制肌管生成,表现为肌管融合指数下降。2)通过蛋白组学分析筛选到549个差异蛋白,其中有66个上调蛋白和483个下调蛋白,差异蛋白主要富集在细胞黏附、脂肪酸代谢以及AMPK通路等,参与调控细胞命运决定、组蛋白甲基化和染色质结构等生物学过程。3)通过蛋白互作关系网络分析发现MMP14与肌源性分化相关蛋白、脂肪生成...     

基于转录组测序的油酸诱导延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化差异表达基因的分析

本研究旨在研究油酸(OA)引起延边牛骨骼肌卫星细胞成脂分化途径的分子调控机制.对从12日 龄延边牛中分离得到的骨骼肌卫星细胞进行体外培养,加入不同浓度OA的诱导分化培养液,进行分化处理,试验设1个空白对照组[CON组,5％马血清(HS)],3个不同浓度OA 诱导组:OAL 组(5％HS+50 μmol/L OA)、OA...     

干扰lnc721对牛骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响

【目的】 探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）,研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】 选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA （lnc721）,通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】 lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）;Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达（P<0.01）,在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调（P<0.01）。【结论】 干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。     

莱芜猪前体脂肪细胞的原代培养及诱导分化研究

为了建立莱芜猪前体脂肪细胞的体外培养体系,探索猪脂肪组织增生的生物学特征。本研究采集1日龄莱芜猪仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法,分离原代前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,以及前体脂肪细胞诱导分化的研究,并采用Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ的表达。结果表明,分离的猪原代前体脂肪细胞约8h后开始贴壁,贴壁的细胞呈短梭形或不规则的三角形,第3天多数细胞进入指数生长期,呈成纤维细胞样形态,细胞生长曲线近似S形;诱导培养结果显示,少量细胞在第2天开始出现脂滴,大多数细胞在第3天出现脂滴,第7～8天小脂滴逐渐融合成大脂滴,在第12天左右融合成大脂滴,油红O染色呈橘红色。在前体脂肪细胞分化过程中PPARγ基因mRNA的表达量逐渐增加,在诱导后的48h表达量最高,随后其表达丰度逐渐下降。本试验成功建立了莱芜猪前体脂肪细胞培养体系和体外诱导分化模型,为进一步研究莱芜猪前体脂肪细胞增殖与分化机制和猪体脂肪的沉积奠定基础。     

干扰lnc4351对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

为探究长链非编码RNA(lncRNA)对牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的影响,本研究以牛骨骼肌卫星细胞及已建立的体外成肌诱导分化模型为基础,以前期高通量测序获得的牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达差异倍数较大的一个预测lncRNA为靶标,对其进行生物信息学分析及亚细胞定位,命名为lnc4351。设计合成lnc4351的siRNA,转染牛骨骼肌卫星细胞,采用EdU染色的方法检测干扰lnc4351对细胞增殖的影响;对转染siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,观察肌管的形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MHC基因的mRNA及蛋白水平的表达变化,研究干扰lnc4351对细胞分化的影响。结果显示,lnc4351位于牛的14号染色体,不具有蛋白编码潜能,是一个未报道过的lncRNA,在牛骨骼肌卫星细胞的细胞质和细胞核内均有分布,主要存在于细胞核;干扰lnc4351表达后,EdU阳性细胞比率显著下降(P<0.05),说明下调lnc4351表达显著抑制了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;下调lnc4351表达后肌卫星细胞经诱导分化产生的肌管量呈现增多趋势,分化标志因子MyoG和MHC的蛋白水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),说明干扰lnc4351能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰lnc4351表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖并促进其成肌分化过程,为进一步开展lncRNA对牛骨骼肌发育的调控机制及肌肉发育相关研究提供参考。     

腺病毒与慢病毒感染猪原代细胞的比较研究

本实验旨在探究腺病毒和慢病毒侵染猪原代细胞的最佳感染复数(MOI)和侵染时间,确定较优的侵染方式。实验选择体外分离培养猪骨骼肌卫星细胞、前体脂肪细胞和骨髓间充质干细胞后,分别用腺病毒(MOI=0、50、100、200、500、1 500)和慢病毒(MOI=0、30、50、80、100、300)感染细胞,每隔24 h在荧光显微镜下观察记录细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明:当腺病毒MOI值为500、慢病毒MOI值为80,侵染4 d后,3种细胞荧光强度均较强且细胞形态完好。相比较而言,腺病毒能快速高效侵染猪骨骼肌卫星细胞;而对于猪前体脂肪细胞和猪骨髓间充质干细胞,2种病毒侵染速度相近,但慢病毒的侵染效率和荧光强度更高。因此,对于猪骨骼肌卫星细胞,选取腺病毒作为外源基因载体更为合适;对于猪前体脂肪细胞和猪骨髓间充质干细胞,慢病毒的侵染效果则更好。